细胞分离和破碎

本章节重点：离心沉降公式推导及应用；离心设备分类及工作原理；细胞破碎普通方法及原理。细胞分离和破碎第1页经过微生物发酵或动植物细胞培养得到原料液，应首先将其中菌体或细胞与培养液分离。假如目标产物为胞外物，可直接利用培养液进行以后分离纯化操作；假如目标产物为胞内物，则要对菌体或细胞进行适当处理，释放目标产物，然后除去细胞或其碎片，再进行目标产物分离纯化。本章介绍细胞分离、目标产物释放以及蛋白质复性主要方法和原理。概述细胞分离和破碎第2页1.1重力沉降重力沉降在化工操作过程中惯用气-固、液-固和液-液分离伎俩，在生物分离过程中亦有较多应用1细胞分离细胞分离和破碎第3页以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受到重力、浮力和阻力作用。

阻力浮力重力细胞分离和破碎第4页1.滞留区：stokes方程10-4<Re<1沉降速度2.过渡区：Allen公式1<Re<103沉降速度3湍流区：Newton公式103<Re<2×105沉降速度细胞分离和破碎第5页普通而言单体细胞直径小、沉降速度很低，满足10-4<Re<1，可使用公式计算当颗粒浓度较大时，颗粒之间相互碰撞相干扰，影响沉降速度。此时，颗粒沉降速度比单一颗粒小，需用空隙率函数f(ε):校正为悬浮液空隙率细胞分离和破碎第6页

菌体和动植物细胞重力沉降即使简便易行，但菌体细胞体积很小，沉降速度很慢。所以，实用上需使菌体细胞凝聚成较大颗粒后进行沉降操作，提升沉降速度。在中性盐作用下，可使菌体表面双电层排斥电位降低，有利于菌体之间产生凝聚。细胞分离和破碎第7页另外，向含菌体料液中加入聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝剂，可使菌体之间产生架桥作用而形成较大凝聚颗粒。凝聚或絮凝不但有利于重力沉降，而且还能够在过滤分离中大大提升过滤速度和质量。当培养液中含有蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而同时过滤除去。细胞分离和破碎第8页1.2离心沉降

离心沉降是科学研究与生产实践中最广泛使用非均相分离伎俩，不但适合用于菌体和细胞回收或除去，而且可用于血球、胞内细胞器、病毒以及蛋白质分离．也广泛应用于液---液相分离。细胞分离和破碎第9页1.2.1离心沉降速度单位质量物质所受到离心力为：

其中N为转速，r为离心机半径离心设备一个主要技术指标是：所能到达离心力与重力比值，称为分离因数。分离因数是衡量离心程度参数r用z表示：细胞分离和破碎第10页注意：科技文件中常将离心操作条件用多少g(如5000g、8000g等)表示．就是将离心力用Zg形式表示。将stokes公式中g用Zg代替，得到离心沉降速度vs公式：

或者：细胞分离和破碎第11页需要注意一个公式：室温下（20℃）某物质在水中沉降系数：一些蛋白质沉降系数表细胞分离和破碎第12页1.2.2离心分离法（1）差速离心分级差速离心(Differentialcentrifugation)是生物化工最惯用离心分离方法。以菌体细胞搜集或除去为目标固液离心分离是分级离心操作一个特殊情况，即为一级分组分离。细胞分离和破碎第13页一些菌体细胞大小和离心操作条件细胞分离和破碎第14页细胞分离和破碎第15页(2)区带离心区带离心是生化工程中主要分离伎俩，依据离心操作条件不一样，又分差速区带离心和平衡区带离心。两种区带离心法均事先在离心管中用某种低分子溶质(如蔗糖溶液）调配好密度梯废，在密度梯度之上加待处理料液进行离心操作。二者区分在于溶质密度梯度中与待分离物质密度梯度不一样。细胞分离和破碎第16页区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大分子分离纯化，但处理量小，普通仅限于试验室水平。20世纪60年代人们开发了区带转子，利用其代替离心管，可增加处理能力。细胞分离和破碎第17页1.2.3.离心分离设备试验室普通用转子离心机。按速度分为低速离心机、高速离心机、超离心机。细胞分离和破碎第18页

工业离心分离设备中，较为惯用有管式和碟片式两大类.管式离心机工作原理：在离心力作用下．管内液面旋转轴为中心圆筒，将轻相（清液）和重相分离开来。缺点是沉降面积小．处理能力较低。细胞分离和破碎第19页普通管式离心机工作参数：细胞分离和破碎第20页碟片式离心机又称板式离心机，离心转子中有许多等间隔碟型分离板，以增大沉降面积和提升处理能力。操作过程，料液从中心进料口输入，经过转子底部液孔进入分离板外径处，进入分离板间隙。经过分离板间隙向转子中心移动过程中，重相受离心力作用而沉降，轻相从转子上部出口排出。连续操作时，重相从喷嘴连续喷出。碟片式离心机结构复杂，离心转数普通较管式离心机低。细胞分离和破碎第21页碟片式离心机工作示意图细胞分离和破碎第22页细胞分离和破碎第23页碟式离心机是立式离心机一个，转鼓装在立轴上端，经过传动装置由电动机驱动而高速旋转。转鼓内有一组相互套叠在一起碟形零件--碟片。碟片与碟片之间留有很小间隙。悬浮液（或乳浊液）由位于转鼓中心进料管加入转鼓。当悬浮液（或乳浊液）流过碟片之间间隙时，固体颗粒（或液滴）在离心机作用下沉降到碟片上形成沉渣（或液层）。沉渣沿碟片表面滑动而脱离碟片并积聚在转鼓内直径最大部位，分离后液体从出液口排出转鼓。碟片作用是缩短固体颗粒（或液滴）沉降距离、扩大转鼓沉降面积，转鼓中因为安装了碟片而大大提升了分离机生产能力。积聚在转鼓内固体在分离机停机后拆开转鼓由人工去除，或经过排渣机构在不停机情况下从转鼓中排出。

细胞分离和破碎第24页主要特点

1）分离能力强，分离因数在5000-9500之间；2）生产能力大，最高达10米3/小时；3）机动性强，依据需要能够自动或手动操作，也能够实现远距离自动操作；4）维修方便主要用途

主要适合用于固形物在1-15%之间，固相颗粒直径大于0.5微米液-液-固分离。比如油类：植物油、动物油、鱼油、乳油、原油、各种原料油、生物柴油、煤焦油、润滑油分离、澄清：乳品澄清；细胞分离和破碎第25页利用薄片形多孔性介质(如滤布)截留固液悬浮液中固体粒子，进行固液分离方法过滤是一个膜分离法1.3过滤细胞分离和破碎第26页滤液透过阻力主要来自于：过滤介质和介质表面堆积滤饼滤饼阻力是影响过滤速度主要原因提升过滤速度方法：

1）对滤液进行絮凝或凝聚预处理，改变料液性质2）在料液中加入助滤剂（如硅藻土）细胞分离和破碎第27页2细胞破碎概述：许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外培养液中，而保留在细胞内。这类生物产物需用上节所述方法搜集菌体或细胞后，进行细胞破碎(celldisruption)，使目标产物选择性地释放到液相中。破碎细胞或其碎片利用上节所述固液分离方法(主要是离心法)除去后，上清液用于深入分离纯化。细胞分离和破碎第28页1）细胞壁动物、植物和微生物细胞结构差异革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间差异细菌与真菌间差异2.1细胞结构细胞分离和破碎第29页细胞膜结构2）细胞膜细胞分离和破碎第30页磷脂分子由疏水和亲水基团组成。疏水基团尾部有两烷基基团，亲水基团头部有两性基团，或者说是醇基，在内膜层中，磷脂尾部聚集在一起，头部暴露在水中，形成磷脂双分子层。细胞分离和破碎第31页原核细胞：细胞质、核糖体真核细胞：细胞核、细胞质、细胞器3）细胞质细胞分离和破碎第32页生物产物存在地：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞器破碎目标：破坏或破碎细胞壁和细胞膜，释放其中目标产物2.2细胞破碎和产物释放原理细胞分离和破碎第33页机理机械破碎法：压缩力和剪切力破坏细胞壁和细胞膜结构化学破碎法：1)改变细胞壁或膜结构，增大胞内物质溶解速率2)完全溶解细胞壁，形成原生质体，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质细胞分离和破碎第34页2.3细胞破碎技术2.3.1机械破碎（1）高压匀浆（高压剪切破碎）影响原因：压力、循环操作次数和温度适合用于酵母和大多数细菌细胞团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞需要安装冷却装置细胞分离和破碎第35页（2）珠磨填充物为玻璃和氧化锆（粒径0.1~1.0mm）破碎效率岁搅拌速度和悬浮液停留时间增大而增大微珠粒径于目标细胞直径比为30~100适合用于大多数微生物细胞，优化设计过程复杂WSK卧式高效全能珠磨机ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机细胞分离和破碎第36页（3）喷雾撞击破碎细胞破碎仅发生在与撞击板撞击一瞬间，细胞破碎程度均匀，破碎程度能够经过无极调整载气压力控制，防止细胞内部结构破坏适合用于大多数微生物细胞和植物细胞细胞分离和破碎第37页（4）超声波破碎超声波作用下液体发生空化作用破碎程度于细胞种类、浓度、超声波声频、声能相关强烈破碎作用，适合用于大多数微生物细胞能量利用率低，过程产生大量热声波传递依照正弦曲线纵向传输，即一层强一层弱，依次传递，当弱声波信号作用于液体中时，会对液体产生一定负压，即液体体积增加，液体中分子空隙加大，形成许许多多微小气泡，而当强声波信号作用于液体时，则会对液体产生一定正压，即液体体积被压缩减小，液体中形成微小气泡被压碎。经研究证实：超声波作用于液体中时，液体中每个气泡破裂会产生能量极大冲击波，相当于瞬间产生几baidu高温和高达上千个大气压，这种现象被称之为---”空化作用”，

细胞分离和破碎第38页方法技术原理效果成本举例机械法高压匀浆细胞被搅拌器劈碎适中适中酵母和大多数细菌珠磨破碎细胞被玻璃珠或铁珠捣碎猛烈廉价细胞悬浮液和植物细胞大规模处理喷雾撞击细胞高速冻结，撞击撞击板，发生破碎猛烈适中细胞悬浮液大规模处理超声波用超声波空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理细胞分离和破碎第39页方法技术原理效果成本举例化学法酸碱处理调整pH改变贺电性质，使蛋白质间作用力降低猛烈廉价化学试剂处理表面活性剂、螯合剂、盐、有机溶剂处理，增大细胞壁通透性；变性剂破坏氢键作用猛烈适中脲、盐酸胍用于细菌细胞酶溶细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵甘露糖酶处理酵母细胞2.3.2化学和生物化学渗透细胞分离和破碎第40页碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较廉价。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了各种反应，包含使磷脂皂化。该操作是细胞增溶很好例子，因为它使细胞壁成份溶于表面活性剂，也使蛋白质变性。该法不但破坏了细胞壁也破坏了产物，所以即便很廉价，碱处理是一个很不惯用方法。细胞分离和破碎第41页渗透压冲击法

高——低渗透压环境中转化冻结——融化法1）破坏细胞膜疏水键结构，增加亲水性和通透性；

2）胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，