血管新生与疾病

血管新生与疾病第1页/共87页

同时治疗性血管新生为缺血性疾病的攻克带来了新的希望。

肿瘤的生长和转移是一个依赖于血管的过程，当肿瘤体积超过1mm3～2mm3时，维持其生长靠新生血管的生成。因而以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗成为近年来的研究热点。

肿瘤和缺血性疾病严重危害人类健康第2页/共87页主要内容概念血管新生的分期与方式血管新生的调控血管新生与疾病的发生和防治第3页/共87页一、概念

在个体发育和器官组织的形成过程中,必有微血管形成,这些微血管按器官组织的功能不同,形成具有一定形状的三维结构,这就是器官组织的微血管血液注系统—微循环单位(microcirculatoryunit).第4页/共87页第5页/共87页血管系统形成有2个主要过程Vasculogenesis—血管形成或称血管发生

主要发生在胚胎早期，由成血管细胞成长，是血管从无到有的过程。Angiogenesis—血管新生

在原有毛细血管与（或）微静脉基础上通过血管内皮细胞增殖和迁移，从先前存在的血管处以芽生或非芽生（或称套叠）的形式生成新的毛细血管。是血管从少到多的过程文献所指的血管生成实际上主要是指血管新生第6页/共87页第7页/共87页二、血管新生的分期与方式（一）分期初期许多体内外的刺激使得促血管生成因子分泌增加，在局部积聚，诱导血管新生。能引起这一变化的刺激有血管损伤、创伤、缺氧、肿瘤生长、局部炎症反应和某些细胞因子。增生侵入期蛋白酶降解细胞外基质(extracellularmatrixECM),松解内皮细胞与周围组织的粘附，内皮细胞增生、迁移和浸润。成熟分化期包括血管管腔形成，内皮细胞分化，血管结构的修整、改建，毛细血管网可根据组织需要进一步增生变密或退化变疏，成熟的血管最终形成。第8页/共87页

第9页/共87页第10页/共87页第11页/共87页第12页/共87页（二）血管新生的方式芽生式毛细血管在原有的基础上发芽（sprouting),分头呈线性长出，VEGF(vascularendothelialgrowthfactor)等促进血管新生的因子常作为趋化剂指引出芽生长的方向。第13页/共87页（二）血管新生的方式2.非芽生式原有的毛细血管被横贯血管的间质突起纵向一分为二，成为两条新的毛细血管,在此之前，被分割的毛细血管常发生内皮细胞增生，管腔变大。另一种血管生长方式称套入式血管新生，已有的毛细血管呈柱状插入管腔，不需要内皮细胞出芽，在管腔内形成套入式的血管新生。血管网络形成时，这两种血管新生方式同时发生，脑血管发育以芽生方式生长为主，肺血管增生以非芽生方式生长为主。第14页/共87页三、血管新生的调控

Hanahan、Folkman和Peper等提出了血管新生的平衡学说，即正常情况下血管新生的诱导和抑制处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统发芽长出新生血管

O`Reilly提出血管新生受到促进血管生成因子和抑制血管生成因子调控，这两种因子的平衡使血管处于正常的生长状态。第15页/共87页（一）血管新生诱导因子分类

诱导剂名称多肽类

VEGF/VPF,bFGF,PDGF,Angiogenin,AngiopoietinTGFα、β

，G-CSF/GM-CSF,IL-1等低分子质量非肽类趋化因子，脂类等未定性因子肝素，铜离子络合物等Angiogenin-血管生成素；Angiopoietin-促血管生成素；G-CSF-粒细胞集落刺激因子；GM-CSF–粒细胞巨噬细胞集落刺激因子第16页/共87页1.血管内皮细胞生长因子（VEGF）

1983年首先由Senger等在豚鼠肿瘤腹腔渗液中以及多种肿瘤细胞培养上清液中发现使豚鼠血管通透性升高的因子，称之为血管通透性因子(vascularpenitreitfactor,VPF)。

1989年，Gospodarwiz等从垂体滤泡细胞培养上清液中分离出一种特异性的促进血管内皮细胞有丝分裂的因子，取名为VEGF。现已证实血管内皮生长因子与以前发现的VPF是同一蛋白质，均由两条相对分子量为24000碱性糖蛋白单链的同源二聚体。第17页/共87页第18页/共87页VEGFDVEGFVEGF165VEGFCVEGF189VEGFAVEGF121VEGFBVEGF206VEGFE促进血管内皮细胞有丝分裂，增加血管内皮通透性仅增加血管内皮通透性4种VEGF是由同一基因转录后以不同VEGFmRNA拼接方式的产物，因此，各种VEGF有相同的抗原决定簇，VEGF抗体与各型VEGF均结合分类第19页/共87页第20页/共87页

VEGF在动物和成人正常组织中合成水平很低，但在胚胎中和在有血管新生的组织中合成水平较高。VEGF在血管新生中，被认为有促进毛细血管融合、大血管生成的作用。第21页/共87页影响VEGF产生的因素活化的癌基因产物Src蛋白NO缺氧（最明显），据报道，细胞在无氧条件下，VEGF的合成可增加12倍。其机制：缺氧缺氧诱导因子（HIF-1）VEGF基因转录(HIF-1:hypoxiainduciblefactor-1)

有人推测暖箱中早产儿氧中毒时的视网膜血管异常增生，可能是发生在出暖箱后（停止输氧），相对缺氧，VEGF分泌增多所促成的。第22页/共87页VEGF受体目前发现的有三种：VEGFR-1，即Flt-1(fms-liketyrosinekinase-1,VEGFR-1)VEGFR-2,即KDR(kinasedomainregion,VEGFR-2)VEGFR-3，即flt-4

三者均属酪氨酸激酶受体VEGFR-2是早期成血管细胞发育所必需，取出该基因的胚胎不仅成血管细胞缺失，造血肝细胞也缺失。VEGFR-1的作用则稍后，使成血管细胞组织成血管。第23页/共87页Flt只在肿瘤细胞内皮细胞上表达，在肿瘤细胞中表达不明显。

KDR不仅在肿瘤血管内皮细胞上表达，而且在肿瘤细胞中也表达。去除2条染色体中的一条VEGF基因，则胚鼠会死于宫内，2条VEGF基因都去除，则出现更早期的血管发育障碍。早期胚胎发育时，VEGF受体所受的刺激可能来自母体的VEGF获VEGF类的其他因子。第24页/共87页第25页/共87页第26页/共87页2.成纤维细胞生长因子

（fibroblastgrowthfactor,FGF）bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）

—研究的最多，分子量为18000的碱性多肽，对内皮细胞有趋化性，直接刺激内皮细胞释放基底膜降解酶，并刺激内皮细胞的迁移和增殖，形成新血管。

FGF家族目前具有22个成员，对成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞发生作用，促进细胞生长、增殖、迁移和分化。第27页/共87页bFGF硫酸肝素bFGF与肝素结合，免受其被破坏第28页/共87页第29页/共87页3.促血管生成素和血管生成素促血管生成素(angiopoietin,Ang)—是一种糖蛋白，相对分子量为70000，由血管内皮细胞和内皮前体细胞产生。Ang有两个亚型，即Ang-1（促进血管生成）和Ang-2（抑制血管生成）。Tie-2是Ang-1和Ang-2的共同受体。Ang-1与Tie-2结合后，趋化局部间质细胞，诱导间质细胞分化为血管周细胞和平滑肌细胞，刺激基质沉积而形成血管。Ang-2是Ang-1的竞争性抑制物。第30页/共87页

Tie-2受体主要在胚胎中表达，去除该基因，可见卵黄囊腔肿大，被主动脉破损、心肌小梁缺如、脑内大小血管几乎一样粗（提示芽生式新生受抑制）、神经外培层的血管芽生式长入受抑制。第31页/共87页血管生成素(angiogenin)

—是一种相对分子质量141000碱性单链多肽，James1983年从腺癌细胞系培养液中提取并纯化，在实验中表现出强烈的刺激血管新生作用。可由正常细胞、淋巴细胞和肝细胞生成。是一种非血管内皮细胞源性有丝分裂原。特点：不与肝素结合体内低剂量即可表现出强烈的刺激绒毛膜尿囊膜（CAM）和兔角膜血管生成活性。第32页/共87页刺激因子内皮细胞增殖内皮细胞迁移内皮细胞分化在体部位血管新生诱导因子及其作用

G-CSF+++角膜GM-CSF+++？VEGF+++角膜,CAM,缺血肌肉bFGF+++角膜,CAMTGF-α+？？地鼠颊囊

TGF-β

+/-,a+/-,a

?角膜,CAMPDGF+++/?,b?PGE1???角膜,CAMPGE2???角膜,CAMNO+,b??肿瘤,角膜,CAM抑制TNF-α+/-,a+,c+角膜,CAMIL-1+/-,b+/-?角膜,CAMIL-6-+??IL-8++?角膜PAF?+?Matrigel*

第33页/共87页（二）血管新生抑制因子

成年机体的血管新生不如胚胎普遍，血管新生的速度在生理状态下也远比病理状态下慢（如肿瘤时），这与体内存在血管新生抑制因子有关。血管新生抑制素（angiostatin)、内皮细胞抑制素（endostatin)组织金属蛋白酶抑制剂（tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP)软骨源性抑制剂(cartilagederivedinhibitor,CDI)凝血敏感蛋白-1(thrombospodin-1,TSF-1)血小板因子-4(plateletefact-4)干扰素诱导蛋白-10(interferoneinducibleprotein-10,IP-10)迁移抑制因子(migrationinhibitorfactor,MIG)第34页/共87页1.血管新生抑制素（angiostatin)

1994年由O’ReillyMS首先发现，是纤溶酶原的降解片断，是纤溶酶原98~440氨基酸残基片断，也是纤溶酶原N段片断。某些蛋白水解酶（如弹性蛋白水解酶）在体外与纤溶酶原或纤溶酶作用即可产生血管新生抑制素。

血管新生抑制素能特异性的抑制内皮细胞增殖，可选择性的调控E-选择素的表达，从而抑制内皮细胞增殖。第35页/共87页angiostatin第36页/共87页2.内皮细胞抑制素（endostatin）

endostatin是胶原XVIII的C端片段，相对分子质量为20000，是胶原XVIII在某些酶的作用下裂解生成，体内产生机制不清。内皮细胞抑制素可与细胞表面的硫酸类肝素硫酸盐蛋白多糖结合，通过与bFGF的竞争，干扰有丝分裂的生长因子信号，从而达到抑制细胞增殖的作用。对内皮细胞增殖的作用较专一，且较血管生成抑制素强。此外，它能促进内皮细胞凋亡。第37页/共87页3.组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）

TIMP能抑制组织金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）。

MMP是内皮细胞分泌的，它能使内皮细胞迁移，新血管生成。当MMP被TIMP抑制后血管新生即被抑制。所以近年来在脏器炎症纤维化和肿瘤的研究中，试图激活TIMP，使MMP抑制，血管生成阻断，炎症纤维化中止，肿瘤缩小。

第38页/共87页4.凝血敏感蛋白-1（TSP-1）

（血小板凝集素）

TSP-1存在于血小板α颗粒中的糖蛋白。是一种内源性血管新生抑制剂，能够阻断血管生长因子诱导的毛细血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。同时能加强平滑肌细胞对PDGF所引起的增殖和迁移反应。第39页/共87页5.血小板因子-4（PF-4）

PF-4来自血小板。实验证明，PF-4能与氨基葡萄糖基结合，阻碍bFGF与受体结合，从而抑制血管新生。其可能途径为：1）PF4直接与bFGF竞争硫酸肝素，而硫酸肝素维持bFGF的活性非常重要。2）PF4直接与bFGF的受体结合，在受体水平与bFGF竞争。3）PF4可能与bFGF形成复合物，并抑制bFGF的二聚体形成。第40页/共87页

当然，血管新生的调控除了受上述诱导剂、抑制剂的作用外，还有很多因素如细胞微环境的改变（如缺氧、pH、NO）、癌基因（c-ras）的激活、抑癌基因的突变（p53）均可通过影响VEGF的表达而调控血管新生。第41页/共87页四、血管新生与疾病的发生和防治

血管新生性疾病主要是指与微血管异常生长相关的疾病，表现为血管新生过度、缺陷或抑制。肿瘤、糖尿病、视网膜病、血管瘤、牛皮癣、类风湿性关节炎、月经失调等血管异常增生的疾病。冠心病、心肌梗死后、脑梗塞后、血管闭塞性血栓性脉管炎等血管新生抑制的疾病。上述疾病的中心发病环节均为血管新生调节障碍，故治疗时均要针对血管新生，对血管异常增生疾病治疗要抗血管新生，对血管新生抑制的疾病治疗要促血管新生。

第42页/共87页(一)肿瘤的血管新生与抗血管新生治疗1.肿瘤的血管新生

肿瘤的生长首先需要建立一个新生血管网络。缺少血供的肿瘤直径一般只能维持在1-2mm以内。新生肿瘤血管表现为结构不规则，生长方式各不相同，提示肿瘤血管生成有着与正常新生血管不同的条件。恶性肿瘤细胞依赖丰富的新生毛细血管网及时得到其迅速无限生长所需的氧气和养料，并运走代谢废物。肿瘤在生长过程中可分泌损伤血管但也可促进新生血管形成的物质。第43页/共87页实验

Bimbrone等在动物模型中观察到瘤栓中恶性瘤细胞在对宿主周围毛细血管浸润性生长的无血管阶段中，瘤细胞生长缓慢，称之为静止状态或休眠状态（dormancystate）。当有新生毛细血管从宿主小静脉壁长入肿瘤组织时，中瘤细胞的生长就加快。第44页/共87页肿瘤的转移必须有以下2个条件：血管内皮细胞分泌的胶原酶和纤溶酶原激活因子使肿瘤细胞从肿瘤组织中脱落；新生血管基底膜不完整，中瘤细胞可通透，并比成熟正常毛细血管更易接受肿瘤细胞，从而为肿瘤细胞的转移提供途径。第45页/共87页实验

利用抗血管内皮某些成分的单抗（如抗CD31、CD34抗原的抗体）染色表明：血管新生主要发生在肿瘤原位或转移病灶的周边部位，对转移病灶计数或对血管密度分级发现血管生成与乳癌的转移呈正相关。检测血管密度可作为乳癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤及其他多种肿瘤预后的一个独立标志。第46页/共87页肿瘤的生长大致可分为2个时期血管前期（prevascularphase），为无血管生长期，肿瘤增殖到大约2mm。血管期（vascularphase），以肿瘤组织中的毛细血管进行性生长为标志。第47页/共87页

肿瘤组织中的血管是由邻近组织中小血管壁芽生并向肿瘤组织内生长成熟的。此过程可分为4个期：血管生长形成期肿瘤组织启动促进血管形成的遗传信息进行表达。通过调节促进或抑制血管新生物质的含量，诱导新血管的生成。内皮细胞和周细胞均含有形成血管腔隙并分支连接成毛细血管网的遗传信息。

第48页/共87页2)基底膜降解期由周围细胞产生的胶原酶和纤溶酶原激活物降解母血管的基底膜和局部基质,使母血管管腔扩张,为内皮细胞迁移提供条件.3)内皮细胞迁移期在血管生长因子作用方向上,内皮细胞发生趋化性生长、迁移，或一个细胞从母血管壁向周围组织长出，或多个细胞同时平行长出。长出的细胞形成突起，突起的中央内皮细胞分裂增殖。第49页/共87页4)管腔形成期

母血管内皮细胞增生形成的细胞索向肿瘤组织长入的过程中,内皮细胞之间逐渐形成裂隙样腔隙,同时被拉长成管状。这些腔隙与母血管腔隙相连，并在内皮细胞和周细胞外围出现基底膜，从而新生血管形成。第50页/共87页第51页/共87页第52页/共87页2.肿瘤血管新生的机制

“血管新生开关”（angiogenicswitch）

在研究血管新生在肿瘤发生和转移中的重要作用及其正负调节因子之间的平衡时提出的概念，它在肿瘤发生时被打开。P53基因经常在中瘤组织中发生突变，使肿瘤在缺氧状态下存活，并上调VEGF表达和下调TSP-1表达，从而打开血管生成开关。第53页/共87页

在肿瘤潜伏期，血管新生诱导因子和血管新生抑制因子之间保持着动态平衡，此时细胞凋亡率很高，一旦血管生成开始，细胞增生将超过细胞凋亡速度。第54页/共87页第55页/共87页

“休眠状态”（dormancystate）

原发瘤能够产生血管新生诱导因子和抑制因子，抑制因子在循环中的半寿期比前者长，在继发肿瘤中的作用超过前者，使肿瘤保持在休眠状态。某些癌症患者发生“肿瘤休眠”的分子基础是TSP，TSP能够使肿瘤转移率降低15-20倍，原发瘤的体积缩小6倍。为TSP抗肿瘤提供了直接证据。第56页/共87页第57页/共87页肿瘤与VEGF肿瘤病人血、尿中VEGF明显增高肿瘤组织中VEGF和VEGFR均升高有远处转移者VEGF更高血管丰富的肿瘤组织中VEGF显著升高VEGF与疗效和预后相关第58页/共87页VEGF引起血管新生的机理VEGF特异性作用于血管内皮细胞，发挥促增殖、促迁移、促趋化作用。VEGF增加血管通透性，Fg等血浆蛋白外渗与组织中纤维连接蛋白等凝结形成纤维蛋白凝胶体，为新生毛管网的建立和肿瘤细胞的生长提供必要的基质。VEGF诱导血管内皮细胞产生间质胶原酶、纤溶酶原激活物。第59页/共87页3.抗血管新生治疗抗血管新生疗法：针对肿瘤血管新生的过程进行治疗，抑制血管新生和肿瘤生长。

血管新生抑制剂（angiogenesisinhibitors），分两大类：A.特异性抗血管新生药，仅抑制VEC增值和转移，对非VEC作用不大，代表性药物如烟曲霉醇（TNF-470）。B.非特异性抗血管新生药，对VEC、肿瘤细胞和其他细胞均有作用，代表性药物为IL-12。第60页/共87页抗血管新生疗法的优点一个血管被破坏后，成千上万个肿瘤细胞坏死。不易产生抗药性。药物很容易找到他的靶细胞。有时药物虽不引起肿瘤缩小，但抑制其生长，为其它治疗提供条件。联合应用效果佳。对小肿瘤治疗比大肿瘤好。第61页/共87页抗血管新生抑制剂应用情况PF-4能非特异的阻断VEGF与VEGFR的结合，抑制内皮细胞增殖、游走，阻止新生血管形成。烟曲霉素及其类似物，如AGM-1470（TNP-740）。其类似物可在很多植物中，如6-磷酸-肌醇（植酸）、豆类、谷类植物中发现。一些小分子化合物，如SV1498等可阻断VEGF受体下游的信号转导。第62页/共87页VEGF的反义cDNA可阻断VEGF的基因表达。某些细胞因子，如INF，IGF，IL-12等。中和血管生成的多肽或其受体，如VEGF抗体、VEGF的可溶性受体。干扰血管基底膜和细胞外基质的抑制剂，如PEX、KB-R7785。其他，抗粘附分子抗体、基因治疗等第63页/共87页第64页/共87页血管靶向疗法

是特异的破坏已存在的血管的方法，从而诱导肿瘤坏死。如细胞因子TNFα大剂量时抑制血管内皮细胞，在四肢转移的黑色素瘤治疗中，四肢局部动脉注射大剂量TNFα，结果特异的破坏肿瘤血管，从而抑制肿瘤生长。第65页/共87页（二）缺血性心血管病与治疗性血管新生

不稳定性心绞痛、急性心梗、冠脉狭窄，AS、以及血栓形成所致的各种缺血性心血管疾病时，侧枝循环代偿尚未充分建立，使组织严重而持续的急性缺氧，即可发生梗死。

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VEGF是一种高度特异的、强烈的血管内皮细胞促分裂因子，能促使生理性或病理性的血管生成，使体内新生血管生成的重要调控物质。促进血管内皮细胞增殖和迁移。促进具有降解基底膜作用的蛋白酶释放。促进内皮细胞形成管腔第67页/共87页

有报道，体内外的缺血、缺氧的心肌细胞VEGF表达明显增加，可推测VEGF可能参加体内缺血心肌的侧枝血管的生成。

临床研究证明，发生心肌梗死后，单纯靠自身生理性血管再生，以适应缺血变化的过程非常缓慢，一般情况下只能部分代偿冠状动脉阻塞引起的心肌缺血，在血管成形术、冠状动脉旁路术无效的时候，人为地增加心肌局部生长因子的浓度，对缓解以致解除心肌缺血状态、减轻心肌坏死有潜在的可能性。这种人工控制的血管新生的方法曾一度叫做“分子搭桥术”（molecularbridging），目前一般称其为治疗性血管新生(therapeuticangiogenesis)。第68页/共87页

目前认为，重建冠脉血供是治疗缺血性心脏病最有效和最根本的方法。有人提出：“冠脉侧支循环的建立将大大改变冠状动脉的历史。

所谓“治疗性血管新生”就是指将外源性生长因子转入组织中来增强缺血区域的侧支血管生长。第69页/共87页侧枝循环形成方式①原先存在的微血管的延长生长或扩张;②血管新生诱导因子作用下毛细血管芽生式新生；③在切应力作用下微血管原位膨大，最后导致新的成熟的血管网形成第70页/共87页VEGF治疗蛋白治疗基因治疗肌肉注射动脉注射渗透泵心腔外注入病毒载体介导脂质介导质粒DNA介导

局部灌注局部注射基因埋线球囊导管导入应用转化细胞包被第71页/共87页

动物实验结果提示，VEGF、FGF等生长因子可以促进冠脉侧支循环的建立，改善心肌血供，减少心肌梗死面积，改善心肌舒张功能。

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Lazarous等人研究狗心肌梗死，模型中采用不同给药途径注入bFGF，发现冠脉内注射、左心房注射及心包内注射bFGF可以观察到心肌血管新生，而静脉注射和SwanGanz导管给药无促血管新生作用。第73页/共87页

在慢性心肌缺血的猪模型中向心肌直接注入VEGF，冠脉血流增加，缺血心肌的局部血流得以部分恢复。有人在冠脉狭窄、闭塞的动物模型中，应用VEGF蛋白作冠脉内注射，每日1次，28d后发现实验组与对照组比，侧支血管增加40％，心肌内分布的血管密度增加90％，并改善冠脉流量，侧支循环形成的数量随VEGF剂量的增加而增加。

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将40例接受冠脉搭桥术的病人随机分人两个组，治疗组心肌注射有活性的FGF-1，对照组注射加热灭活的FGF，随访3个月、3年的冠脉造影结果都显示治疗组较对照组血管数明显增加