试谈肠道致病菌的检验与鉴定

肠道致病菌检验与判定试谈肠道致病菌的检验与鉴定第1页第一节概述一、食品中常见肠道致病菌沙门氏菌志贺氏菌大肠艾希氏菌变形杆菌耶尔森菌试谈肠道致病菌的检验与鉴定第2页二、生物学特征1、形态与染色均为革兰氏阴性杆菌，中等大小，无芽胞，多数含有周身鞭毛能运动，志贺氏菌属无鞭毛无动力。2、培养和生化反应（1）需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑，液体培养基混浊生长。（2）肠道致病菌普通不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖产酸或产酸产气。（3）可还原硝酸盐为亚硝酸盐。

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第3页

三、抗原类型

O抗原也称菌体抗原，细胞壁脂肪糖，耐热100℃不被破坏H抗原也称鞭毛抗原，鞭毛蛋白，不耐热，60℃30′可破坏K抗原也称表面抗原（荚膜抗原），多糖，含有阻抑O抗原发生凝集现象，加热60℃30′可消除抑阻作用菌毛抗原试谈肠道致病菌的检验与鉴定第4页四、致病性（一）、致病物质1、内毒素：能引发机体发烧，白细胞降低，低血糖，血压降低，严重者休克。2、外毒素：对小肠粘膜细胞含有特殊毒害作用，引发腹泻。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第5页（二）、所致病疾

1、伤寒和副伤寒

2、食物中毒

3、细菌性痢疾试谈肠道致病菌的检验与鉴定第6页

五、微生物检验基本程序

检样→处理→增菌培养→分离培养→生化试验→血清学判定→汇报

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第7页第二节、沙门氏菌检验一、概况（一）沙门氏菌命名依据所致疾病命名依据菌发觉地域命名以发觉者名字命名（二）沙门氏菌抵抗力

60℃30′可杀死试谈肠道致病菌的检验与鉴定第8页

（三）沙门氏菌分类地位及定义1、地位：是肠杆菌科中细菌2、定义肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及抗原结构相同，被O1噬菌体裂解一群革兰氏阴性杆菌。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第9页二、生物学特征

（一）、形态与染色：革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。（二）、培养特征

1、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.4。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第10页(沙门氏菌（红色）侵入人体细胞

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第11页2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，直径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐菌落3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第12页（三）、生化特征1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金盏花醇3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（V—P）（-），4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+）5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱氨酸（-）试谈肠道致病菌的检验与鉴定第13页（四）、抗原结构主要两种：

A、O抗原

B、H抗原

C、表面抗原（K抗原）

D、菌毛抗原试谈肠道致病菌的检验与鉴定第14页2、O抗原（1）O抗原表示方法共有58种，用字母O和阿拉伯数字标识：O1、O2、O3、O4如：伤寒杆菌：O9、O12试谈肠道致病菌的检验与鉴定第15页（2）沙门氏菌分群及表示方法用大写字母及相关符号表示：

A、B、C、D、E…、O51~O63、O65~O67试谈肠道致病菌的检验与鉴定第16页（3）沙门氏菌中主要菌群及其群特异性抗原

A群----O2

B群----O4

C群----O6

C1群----O7、C2群----O6O8

、

C3群----O8、C4群----O6O7O14

D群----O9

F群----O11E群----O3E2群----O3、O10族

E3群----O3、O15E4群----O1、O3、O19试谈肠道致病菌的检验与鉴定第17页3、H抗原（鞭毛抗原）

耐热性差：60℃15′或酒精处理可破坏沙门氏H抗原有两种：第1相：特异相，用英文小写字母表示a、b、c……zz1~z55第2相：非特异相，用阿拉伯数字表示1、2、3……其中也有用小写字母a、n、x等表示。

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第18页4、表面抗原：

沙门氏菌有三种：Vi、M、K抗原Vi抗原位于菌体最表层，包围了O抗原，可妨碍O抗原血清学凝集试验。破坏Vi抗原：60℃30′，100℃5′含有Vi抗原沙门氏菌：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第19页三、沙门氏菌食物中毒

（一）、引发食物中毒最常见沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌（二）、易引发沙门氏菌中毒食品

肉、蛋、乳类食品行业关注：美国两种花生酱含沙门氏菌

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第20页(三)、中毒原因

1、食用病畜禽肉制品食品

2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染

3、用不洁净水处理食品

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第21页（四）、临床病状（所致病菌）

1、肠热病：伤寒与副伤寒病，为慢性发烧菌血病。由伤寒与副伤寒菌引发，潜伏期7~20天2、急性肠胃类：主要症状：头痛、发烧、恶心、呕吐、腹泻、出冷汗、及全身不适，病程2~3天3、败血病：高烧、寒战、厌食、局部发炎、由猪霍乱沙门氏菌等引发

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第22页四、微生物检验

（一）、基本步骤（程序）检样→增菌（前增菌）→分离培养→生化试验初步判定→血清学反应最终判定→汇报

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第23页1、前增菌：用无选择性培养基使处于濒死状态细菌恢复活力;2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌受到抑制;3、选择性平板分离培养：分离出所需细菌;4、生化试验：判定分离出来细菌是否符合所检项目标细菌;5、血清学判定：深入判定。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第24页（二）、检验操作关键点

1、前增菌：使待检菌复壮

前增菌：增菌液普通用BPW,36±℃，18~24h，长有杂菌。

2、选择性增菌：抑制杂菌生长，提升检出率

选择性增菌：增菌液用TTB42±1℃，18~24h和SC36±℃，18~24h。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第25页2、平板分离

选择性培养基：BS、XLD（或HE、显色培养基）BS：黑色金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些形成绿色菌落，周围培养基不变。HE：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎黑色；有些为黄色，中心黑色或几乎全黑。XLD：粉红色，带或不带黑色中心，可呈大带光泽黑色中心，或全黑色菌落；有些菌落为黄色，带或不带黑色中心。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第26页BS上菌落HE上菌落显色培养基上菌落XLD上菌落试谈肠道致病菌的检验与鉴定第27页3、五项生化试验

H2S、靛基质、PH7.2尿素酶、KCN、赖氨酸脱羧酶

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第28页

硫化氢（H2S）试验

挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于36±1℃培养24~48h，观察结果。培养基底部呈黑色，为阳性，记+培养基底部无黑色，为阴性，记-试谈肠道致病菌的检验与鉴定第29页三糖铁培养培养经典沙门氏菌在三糖铁培养上特征：表面（-）粉红色、底层（+）黄色、H2S（+）底层有黑色、有动力。在TSI培养基中：表面（+）黄色、H2S（-）培养物可排除，其它培养物都有可能是沙门氏菌。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第30页靛基质试验靛基质+试谈肠道致病菌的检验与鉴定第31页尿素酶试验阳性试谈肠道致病菌的检验与鉴定第32页赖氨酸脱羧酶试验取待检菌，分别接种于含有赖氨酸培养基内和不含赖氨酸对照培养基内，在36±1℃培养1~4天，天天观察结果。试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记-。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第33页氰化钾试验

取培养20～24h营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，马上以橡胶塞塞紧，36±1℃培养24～48h，观察结果。对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第34页（2）、经典沙门氏菌五项生化反应及其检验利用A、经典五项生化反应：A1H2S（+）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧酶（+）如尿素、KCN、赖氨酸脱羧酶有1项异常，按表判定尿素KCN赖氨酸脱羧酶判定结果---甲副-++沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ+-+沙门氏菌个别变体试谈肠道致病菌的检验与鉴定第35页B、利用五项生化反应判定沙门氏菌最简单方案

a、五项生化反应：A2H2S（+）靛基质（+）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧酶（+），补做甘露醇和山梨醇试验，均为阳性为沙门靛基质阳性变体，需结合血清判定结果。b、五项生化反应：A3H2S（-）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧E（+/-），补做ONPE试验，ONPE（-）为沙门氏菌，ONPE（+）大肠艾希氏菌必要时进行沙门氏菌生化菌群判别试谈肠道致病菌的检验与鉴定第36页5、血清学试验（最终判定）

（1）、沙门氏菌诊疗血清种类：

10种组合血清：主要用于伤寒和副伤寒沙门氏菌判定

26种组合血清：常见致病菌定群与分型

57种组合血清：常见定型，初步判定A—F群以外菌型144种组合血清：全套装

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第37页（2）、血清学检验步骤

抗原准备→→

A—F多价血清检验（判定是否是沙门氏菌）→→群特异性抗体血清（如O2、O4、O3、O7、O8、O9、O10、O11（判定O群别）→→O单因子血清检验→

→H因子血清检验（分型）→→汇报

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第38页五、检验结果汇报1、凡血清学判定与生化反应均符合者，汇报检出沙门氏菌。经检验，汇报25g（mL）XX食品中检出沙门氏菌2、凡血清学判定与生化反应均不符合者，汇报XX食品中未检出沙门氏菌。

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第39页思索题：1、经典沙门氏菌五项生化试验结果怎样？2、沙门氏菌形态特征，培养特征是什么？3、沙门氏菌检验时为何要进行前增菌和增菌？4、沙门氏菌有哪些抗原？各有何特点？O、H抗原怎样表示，A—F群沙门氏菌中，代表每群O特异性抗原独特因子是什么？试谈肠道致病菌的检验与鉴定第40页5、沙门氏菌哪几个菌型含有Vi抗原，Vi抗原对O抗原血清涟试验有何影响，对含Vi抗原菌，怎样做O抗原血清学试验。6、沙门氏菌在SS平板，TSI培养基上生长现象怎样，说明其原理。7、分离纯化后怎样选取最少生化试验方法初步判定检验菌是否是沙门氏菌属细菌。8、怎样进行沙门氏菌血清学试验。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第41页第三节、志贺氏菌检验一、生物学特征（一）、形态与染色革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛

2~3um*0.5~0.7um试谈肠道致病菌的检验与鉴定第42页（二）、培养特征1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.42、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小菌落3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第43页（三）、生化反应1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。4、甲基红阳性。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第44页（四）、抗原结构1、抗原组成：O抗原：群特异性抗原：A、B、C、DK抗原：除B群外，普通有K抗原试谈肠道致病菌的检验与鉴定第45页2、志贺氏菌分群与血清型志贺氏菌分为四群：A群（痢疾志贺氏菌）：1~10型

B群（福氏志贺氏菌）：1~6型+X、Y两个变种，C群（鲍氏志贺氏菌）：1~15型D群（宋内氏志贺氏菌）

：1个型试谈肠道致病菌的检验与鉴定第46页志贺氏菌属抗原分类菌名

血清分类生化特性群型亚型甘露醇鸟氨酸脱羧酶痢疾志贺氏菌A1～10

－-福氏菌B1～6x、y变种1a、1b、2a、2b、3a、3b3c、4a、4b+-鲍氏菌C1～15

+-宋内氏菌D1

++试谈肠道致病菌的检验与鉴定第47页葡萄糖+乳糖-甘露醇-痢疾志贺氏菌1、3、4、5、6、9、10型痢疾志贺氏菌2、7、8型福氏6型，鲍氏1、2、3、4、5、6、8、10、12、14型福氏痢疾菌（1、2、3、4、5型）鲍氏5、7、9、11、13、15型靛基质-乳糖+宋氏志贺氏菌

靛基质-靛基质+靛基质-靛基质+甘露醇+试谈肠道致病菌的检验与鉴定第48页3、属内外抗原关系（1）群内抗原关系：

A群：2与10型，含有亲密关系

C群：1与4和11型，10与11相关

B群：群抗原是B群各型之间共同抗原（2）群间抗原关系：

C群17型与A群3型相关

C群18型与A群11型相关试谈肠道致病菌的检验与鉴定第49页（3）属外抗原关系：

志贺氏菌与埃希氏菌属O抗原关系非常亲密，除A群9型和D群宋氏菌与埃氏希菌O抗原关系未见报道外，每一个型都与一定埃希氏菌O抗原相关。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第50页4、K抗原对O抗原血清学试验影响

可妨碍O抗原血清学凝集试验，煮沸处理即可。

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第51页（五）志贺氏菌抵抗力志贺氏菌属在外界环境中生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。普通在潮湿土壤中能存活34天，37℃水中存活20天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-60℃10分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第52页二、志贺氏菌致病性与食物中毒（一）流行病学试谈肠道致病菌的检验与鉴定第53页传染源食物、病人、粪便、苍蝇等试谈肠道致病菌的检验与鉴定第54页（二）志贺氏菌致病性致病原因：侵袭力、菌体内毒素、外毒素试谈肠道致病菌的检验与鉴定第55页（二）临床症状A、急性细菌性痢疾：急性经典、急性非经典、急性中毒性菌痢。

B、慢性细菌性痢疾：慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第56页三、微生物检验

（一）检验步骤（程序）检样→样品处理→增菌培养→HE或SS、麦康凯或EMB平板分离培养→初步生化判定→最终血清学判定→汇报试谈肠道致病菌的检验与鉴定第57页（二）检验操作关键点志贺氏菌在常温中生存时间较短，应尽快进行试验。如24h内不能检验，样品应在冰箱内长时间不能检验，放在低温冰箱内。

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第58页1、增菌培养培养基：GN增菌液在36±1℃6—8h，当培养液出现轻微混浊即中止培养。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第59页2、分离培养

强选择性平板：SS或HE弱选择性平板：EMB或麦康凯在孵箱中36±1℃培养18—24h，菌落特征：无色透明，中等大小，光滑圆形菌落。试谈肠道致病菌的检验与鉴定第60页HE平板原理及反应

发酵乳糖某种肠杆菌不发酵乳糖某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌不发酵乳糖肠道菌，可能就是志贺氏菌试谈肠道致病菌的检验与鉴定第61页SS平板原理及反应SSAgar(SalmonellaShigellaAgar)大肠杆菌或者别发酵乳糖肠杆菌是沙门氏菌。有黑色中心。假如没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了试谈肠道致病菌的检验与鉴定第62页麦康凯琼脂平板

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第63页EMB平板照片及原理

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第64页3、初步生化判定

从平板上挑取3—4个可疑菌落，接种于TSI和葡萄糖半固体培养基各一管，36℃，18—24h，试谈肠道致病菌的检验与鉴定第65页三糖铁（TSI）琼脂试验原理2－志贺氏菌3－沙门氏菌4－大肠杆菌

葡萄糖半固体原理及结果。OrganismTestResult

1.Pseudomonasaeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile

2.Staphylococcusaureus：Non-motile

3.Bacillussubtilis：Motile试谈肠道致病菌的检验与鉴定第66页志贺氏菌在TSI生长结果（现象）：（1）斜面产碱仍为红色或粉红色；（2）底层产酸不产气，变黄色；（3）不产H2S，不出现黑色。志贺氏菌在半固体培养基生长：沿线生长，无动力。

试谈肠道致病菌的检验与鉴定第67页在志贺氏菌检验中可弃去培养物：（1）在TSI表面上