抗体制药专题知识讲座

抗体制药专题知识讲座抗体制药专题知识讲座第1页抗体—应用于免疫治疗与免疫诊疗免疫缺点；肿瘤；感染；本身免疫病；超敏反应；移植排斥；炎症。抗体制药专题知识讲座第2页中和毒素；介导溶解病原微生物；介导溶解淋巴细胞；中和炎症因子；作为靶向性载体。抗体治疗作用机制：抗体制药专题知识讲座第3页第一节概述第二节单克隆抗体第三节鼠源性单克隆抗体改造第四节基因工程抗体和抗体工程第五节抗体诊疗试剂第六节抗体治疗药品抗体制药专题知识讲座第4页第一节概述1890年发觉白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体治疗之先河。传统免疫疗法：比如现在仍在使用破伤风抗毒素血清。SARS病毒免疫治疗：比如钟南山提倡使用以SARS痊愈病人血清来治疗SARS病人。1937年，电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种球蛋白、乙种球蛋白、丙种球蛋白，那么抗体属于哪一个蛋白？抗体制药专题知识讲座第5页抗体：能与对应抗原特异性结合含有免疫功效球蛋白。免疫球蛋白：含有抗体活性及化学结构与抗体相同球蛋白。抗体=免疫球蛋白？抗体是生物学上功效概念，而免疫球蛋白则是化学结构上概念。抗体∈免疫球蛋白，免疫球蛋白≠抗体比如：多发性骨髓瘤细胞也能分泌一些同抗体分子结构类似球蛋白，即免疫球蛋白。抗体制药专题知识讲座第6页多克隆抗体：在作为诊疗试剂使用时候，轻易发生交叉免疫反应，造成假阳性发生。单克隆抗体：高度特异性、均一性、起源稳定可大量生产，主要用于疾病诊疗与治疗。诊疗：比如利用单克隆抗体检测与一些疾病相关抗原、辅助临床诊疗或用放射性核素标识单抗进行肿瘤显像。治疗：比如针对T淋巴细胞分化抗原CD3单抗，可用作免疫抑制剂抑制器官移植中排斥反应，现已上市。以单抗为载体药品可对肿瘤进行导向治疗。抗体制药专题知识讲座第7页单抗介导免疫疗法缺点：（1）鼠原性单抗含有抗原性，轻易引发人抗鼠免疫反应，从而降低药品半衰期。（2）完整抗体分子太大，不易穿透实体瘤组织。处理方法：（1）降低单抗免疫原性（单抗人原化或基因工程抗体）（2）降低单抗分子量改进抗体：改形抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽（最小识别单位）。这些改进抗体许多原来鼠源性单抗生物学活性消失，如激活补体、免疫调理、ADCC等，只保留了同抗原特异性结合活性。抗体制药专题知识讲座第8页第二节单克隆抗体单克隆抗体制备一、抗原与动物免疫二、细胞融合与杂交瘤细胞培养三、筛选阳性克隆与克隆化四、杂交瘤细胞与抗体性状判定五、单克隆抗体大量制备六、单克隆抗体纯化抗体制药专题知识讲座第9页抗体制药专题知识讲座第10页抗体制药专题知识讲座第11页一、抗原与动物免疫（1）抗原制备（2）免疫动物选择（3）免疫方法：I.体内免疫法：免疫原性强、抗原量多时应用。普通在采集脾细胞前3日由静脉注射最终一次抗原，使对应B淋巴细胞克隆受到可靠最大程度刺激后分裂增殖。II.体外免疫法：应用于制备人源性单克隆抗体，或抗原免疫原性极弱且能引发免疫抑制时使用。详细方法就是制备脾细胞，进行细胞培养，加入抗原刺激，然后分离脾细胞进入融合。抗体制药专题知识讲座第12页二、细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养细胞融合基础方法：取适量脾细胞（1X108）与骨髓瘤细胞（2~3X107）进行混合，在PEG作用下诱导融合，时间控制在2min内，融后用培养液将PEG融合液迟缓稀释。PEG：分子量和浓度大，则促融合率高，但粘度和毒性也大。常见分子量为4000，浓度为40~50%。为了提升融合率，也常见DMSO来提升细胞接触紧密性，增加融合率。融合后结果：脾-脾，瘤-瘤，脾-瘤及未融合细胞。在正常培养基中，哪种细胞生长速度最慢？抗体制药专题知识讲座第13页细胞DNA合成与HAT选择培养基：（1）主路径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为主要辅酶参加这一合成过程。（2）辅助路径：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化作用合成DNA。选择培养基：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。氨甲蝶呤是叶酸拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常路径合成DNA，而融合所用瘤细胞是经毒性培养基选出HGPRT－细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞含有亲代双方遗传性能，可在HAT培养基中长久存活与繁殖喂养细胞：能释放生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能去除死亡细胞，常见为喂养细胞。抗体制药专题知识讲座第14页三、筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆：常见方法有ELISA，放免，荧光免疫等，经过筛选可得到所需要产单抗细胞株。阳性细胞克隆化：指筛选得到阳性细胞经过无性繁殖而得到细胞集团培养过程。普通经过3次克隆，可得到纯阳性克隆。克隆化常见方法为有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：经过有限稀释，使每孔中理论上只有一个细胞，经过喂养细胞帮助成长为克隆。第一次应使用HT培养基，其后用正常培养基即可。软琼脂法：培养基中加入0.5%琼脂，将克隆打坏后再继续培养。抗体制药专题知识讲座第15页四、杂交瘤细胞与抗体性状判定杂交瘤细胞判定：主要是染色体分析。正常鼠脾细胞染色体数为40，全部是端着丝粒染色体；小鼠骨髓瘤染色体数变异大，多为非整倍性，而且有中部着丝点染色体和亚中部着丝点染色体。杂交瘤细胞染色体在数目上靠近两种亲本细胞染色体数目标总和，在结构上多数为端着丝粒。染色体数目多而集中杂交瘤细胞能稳定分泌高效价抗体，而染色体数目少且分散杂交瘤细胞分泌抗体能力较低。其它判定：Ig类和亚类判定；亲和力判定；单克隆抗体特异性、纯度和识别抗原相对分子量等进行判定抗体制药专题知识讲座第16页五、单克隆抗体大量制备体外培养法：（1）传统培养方法：RPMI1640培养液，10~20%小牛或胎牛血清，但因为杂蛋白太多，纯化困难。如采取无血清培养基（白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺），但产量低。普通来说，可取得10ug/ml抗体。（2）悬浮培养方法：悬浮培养或用DEAE-SephadexA50作为载体进行微载体悬浮培养。动物体内诱生法：在接种细胞前1~2周，注入降植烷（或液体石蜡)0.5ml破坏腹腔内膜，接种1x106瘤细胞，生成腹水后抽取几次可达10ml。优点是抗体效价高，量多，但也存在纯化困难问题。抗体制药专题知识讲座第17页六、单克隆抗体纯化（1）澄清和沉淀处理：腹水离心搜集上清夜微孔滤膜过滤去除细胞等杂质去除细菌、支原体等搜集滤液50%饱和度硫酸铵沉淀90%以上单抗可被回收抗体制药专题知识讲座第18页（2）分离1）凝胶过滤：用于IgG,IgM类抗体纯化。常见SephadexG200作分离介质，可搜集3个峰，最高峰为IgM，另2个峰为IgG，抗体回收率50~80%，纯度95%以上。2）阴离子交换层析：用于IgG类单抗纯化。比如：pH7.4，IgG1和IgG2能结合DEAE，随离子强度逐步升高，依次洗脱IgG2a、2b以IgG3。3）亲和层析：用蛋白A亲和纯化IgG类单抗。pH8.0,单抗结合；pH3.5,洗脱IgG2b；pH4.0,洗脱IgG3；pH4.5,洗脱IgG2a；pH6.0,洗脱IgG1抗体制药专题知识讲座第19页抗体制药专题知识讲座第20页抗细胞表面分子单抗：抗CD3McAb：主要经过细胞去除、功效性受体封阻、免疫调变、刺激抑制细胞增殖等路径杀伤成熟T细胞或阻断机体细胞免疫反应到达抗排斥目标。1986年美国FDA已同意应用小鼠抗CD3McAb治疗急性肾移植排斥反应。CD3McAb治疗心、肝移植排斥反应已完成Ⅲ期临床试验，正申请投放市场。抗体制药专题知识讲座第21页抗CD4McAb：含有干扰发育中T细胞、妨碍CD4分子识别、去除CD4+T细胞、抑制T细胞活化以及抑制对靶细胞杀伤等作用。可作为免疫抑制剂用于同种异体器官移植排斥反应治疗、免疫耐受诱导以及本身免疫性疾病治疗等。治疗HIV感染，I期临床试验。1991年美国风湿病年会上报道了用抗CD4McAb治疗类风湿性关节炎（RA）。抗CD4嵌合抗体（Centocor企业）治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症也已进入Ⅱ期临床验证。抗CD4McAb（OrthoBiotech企业）预防器官移植排斥反应已开始临床验。抗体制药专题知识讲座第22页抗细胞因子单抗：抗IL1、TNFMcAb：抗炎抗体导向药品治疗：放射免疫疗法抗体导向化学疗法：甲氨蝶呤、长春新碱、阿霉素免疫毒素疗法：蓖麻毒素、白喉毒素抗体制药专题知识讲座第23页抗体制药专题知识讲座第24页第三节鼠源性单克隆抗体改造抗体改造目标：（1）降低免疫原性；（2）降低分子量鼠源性单抗存在问题：分子量大，穿透力低；抗原性强，易降低药效及引发副作用。抗体改造标准：保持抗体与抗原特异性结合能力抗体制药专题知识讲座第25页抗体基础结构

(一)重链（heavychain，H）

2条

轻链（lightchain，L）2条

(二)可变区（variableregion,V区）恒定区（constantregion,C区）

(三)超变区（

hyper-variableregion,HVR),又称

互补决定区(complementarydetermining

region,CDR）

骨架区（frameworkregion,

FR）

(四)铰链区（hingeregion）抗体制药专题知识讲座第26页抗体制药专题知识讲座第27页一、人-鼠嵌合抗体提取瘤细胞mRNAcDNA逆转录VH,VL基因特异性引物PCR形成人-鼠嵌合V-C区基因质粒上游开启子、前导肽序列、下游剪切供体信号、增强子克隆到人抗体轻、重链C区基因真核表示载体转染骨髓瘤细胞脂质体介导筛选阳性细胞培养、表示人-鼠嵌合抗体抗体制药专题知识讲座第28页抗体制药专题知识讲座第29页二、改形抗体Ig分子中参加组成抗原结合部位区域是H和L链V区中互补性决定区（CDR区），不是整个可变区。H链和L链各有三个CDR，其余为框架区。改形抗体：用鼠源性单抗CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，可使人Ig分子含有鼠源性单抗抗原结合特异性，又因抗体中鼠源个别百分比少而基础消除了免疫原性，又称CDR移植抗体。抗体制药专题知识讲座第30页改形抗体问题：抗体亲和力下降，甚至丧失活性，原因是人Ig分子框架区中一些氨基酸与鼠IgCDR区不协调。处理方案一：将鼠与亲和性相关残基引入人Ig框架区中，可显著提升抗体亲和力。处理方案二：选择与鼠源性单抗同源性最大人Ig分子为框架区序列，再将人Ig中较为独特残基替换成鼠CDR区附近框架区残基。抗体制药专题知识讲座第31页模板替换：用与鼠对应个别有较大同源性人框架区替换鼠框架区。表面重塑：对鼠CDR及框架区表面残基进行镶嵌或重塑使其类似于人抗体CDR轮廓或人框架区。赔偿变换：在人框架区选择与CDR有相互作用，与抗体亲和力有亲密关系或对框架区空间结构折叠起关键作用残基进行改变，以赔偿完全CDR移植。定位保留：在人源化改形抗体中保留了鼠源性抗体可变区中参加抗原结合氨基酸残基，包含CDR区和框架区中一些关键残基。抗体制药专题知识讲座第32页三、小分子抗体人-鼠嵌合抗体即使能个别处理鼠源性单抗抗原性问题，但不能处理抗体分子量大，不易穿透组织缺点。基因工程小分子抗体仅表示鼠源性单抗V区（即保留了CDR区），而Ig分子C区不表示，所以其分子量仅为原抗体1/80~1/3。抗体制药专题知识讲座第33页小分子抗体（1）Fab片断抗体：包含有重链VH+CH1以及完整轻链。（2）FV抗体：由VH和VL组成。（3）单链抗体：由抗体VH和VL经过一段连接肽连接而成重组蛋白，含有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点，且易与效应分子相连接，构建各种新功效抗体分子，是构建免疫毒素和双特异性抗体理想元件。（4）单域抗体：由VH或VL单个可变区组成，只有抗体分子1/12，表面疏水性强，与抗原特异性结合能力弱。（5）最小识别单位：由单个CDR区组成小分子抗体，含有与抗原结合能力，但亲和力低，也称超变区多肽。抗体制药专题知识讲座第34页抗体制药专题知识讲座第35页单链抗体优点：（1）可去除许多造成非特异性反应竞争性表面蛋白，肿瘤显像背景更清楚。（2）更轻易渗透到肿瘤组织中，增加有效药品浓度。（3）分子量小，抗原性小，能消除人抗鼠排异反应，从而延长在人体内半衰期。

单链抗体构建方法一：杂交瘤细胞提取mRNA反转录cDNAPCR扩增VH和VL基因合成接头用接头将VLC端和VHN端或VHC端与VLN端连接单链抗体单链抗体抗体制药专题知识讲座第36页接头：又称linker，必须能使重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当构型，并尽可能降低蛋白酶攻击和预防单链聚集。Linker长度为14~25个氨基酸为宜，当前最常见为15肽序列（Gly4Ser）3。方法二：噬菌体表面展现技术，可用于单链抗体构建。单链抗体可在大肠杆菌中表示，有3种表示方式（1）直接在细胞质中表示（2）与其它菌体蛋白融合表示成融合蛋白（3）分泌表示含有功效单链抗体：将单链抗体基因与引导分泌信号肽基因相连接，使表示产物分泌出来，取得有活性可溶性表示产物。抗体制药专题知识讲座第37页四、双功效抗体（1）化学交联法：用化学试剂交联Ig分子表面巯基。（2）生物学方法：将分泌单抗杂交瘤细胞与分泌另一个抗体脾细胞融合，形成可分泌两种亲代抗体和杂种抗体杂种-杂交瘤细胞。（3）基因工程法：用接头连接不一样抗体VH和VL区，使它们不能形成链内分子内配对，让其形成原抗体分子内配对，构建双特异性抗体（SCFV)2。抗体制药专题知识讲座第38页双功效抗体优点：防止了化学交联反抗体损害，又可定向结合抗原部位，降低非特异性分布和副作用。双功效抗体抗肿瘤：双功效抗体一个臂识别肿瘤相关抗原，另一个臂识别免疫效应细胞及分子，如CD3、毒素、药品等，介导T淋巴细胞、LAK细胞或毒素与药品发挥细胞毒作用。CD3分子主要功效是参加TCR/CD3复合体装配和稳定以及信号转导NK细胞或T细胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀伤NK不敏感肿瘤细胞杀伤细胞，称为淋巴因子激活杀伤细胞（lymphokineactivatedkillercells,LAK）。抗体制药专题知识讲座第39页

抗体制药专题知识讲座第40页五、抗体融合蛋白（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ

（2）配基-Ig型嵌合蛋白，如IL-2-Ig，应用较为成熟。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3（4）受体-FV型融合蛋白（5）酶-抗体型融合蛋白：即为抗体酶，当抗体酶和肿瘤结合后，给与前体药品，在酶转化下成为有效药品，可提升组织内药品浓度，提升药效，降低毒副作用。抗体制药专题知识讲座第41页抗体制药专题知识讲座第42页抗体融合蛋白构建：将第一个蛋白终止密码子去除，再接上带有终止密码子第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表示。抗体融合蛋白也需用到linker，普通3~5个氨基酸即可，如加入一段疏水性和一定伸展性较长肽段，可很好缓解两种蛋白相互干扰。抗体融合蛋白，可用原核或真核细胞表示。抗体制药专题知识讲座第43页原核表示：（1）分泌至菌体外表示，成为有活性可溶性融合蛋白；（2）包含体形式表示，需溶解后重新折叠成有活性蛋白质。真核表示：能正确折叠和糖基化，但产量低。融合蛋白纯化，采取常规离子交换或亲和层析方法。抗体制药专题知识讲座第44页抗体制药专题知识讲座第45页第四节基因工程抗体和抗体工程抗体发展三个阶段：（1）1890年Behring发觉白喉抗毒素为代表，特点是用抗原免疫动物可取得多克隆抗体。（2）1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表。（3）1994年Winter以基因工程及噬菌体表面展现技术制备噬菌体抗体库，从而制备基因工程抗体。抗体制药专题知识讲座第46页一、噬菌体抗体库技术基础方法1、获取目标基因：提取mRNA—反转录—获得抗体某一特定基因区段。抗体基因组合多为单链抗体，也有用linker组合成功效分子。2、抗体库技术载体：常见噬粒，含有噬菌体和质粒共同特点。抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白形式表示于噬菌体表面，感染大肠杆菌，使目标克隆得以扩增。抗体制药专题知识讲座第47页构建噬菌体抗体载体时，在抗体基因与gⅢ基因之间引入了一个琥珀终止密码子，抗体基因重组子若转化含有琥珀抑制基因XLBlue宿主菌，抗体基因和gⅢ基因成为一个开放阅读框架，这时抗体就能借助噬菌体外壳蛋白而展现在噬菌体表面。如将重组子转化不带有琥珀抑制基因宿主菌，因为抗体基因与gⅢ基因之间终止密码子抑制了gⅢ基因表示，便产生可溶性Fab抗体。抗体制药专题知识讲座第48页3.淘筛：吸附—洗脱—扩增

④再次感染大肠杆菌，使特异噬菌体抗体淘筛。①噬菌体吸附靶抗原。②重复洗涤去除非特异性结合。③洗脱并搜集与抗原结合噬菌体。4.表示与判定目标克隆经过判定后，导入感受态菌株，其产物用westernblot检测。抗体制药专题知识讲座第49页二、噬菌体抗体库技术特点1、模拟天然全套抗体库：建库外源基因为人体多克隆细胞总mRNA；使用通用引物来自多个人体，含有些人种属普遍性。抗体VH和VL随机重组也增加了抗体多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术3、可取得高亲和力人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程。抗体制药专题知识讲座第50页三、基因工程抗体表示1、原核表示2、真核细胞表示3、转基因植物表示4、转基因动物表示抗体制药专题知识讲座第51页第五节抗体诊疗试剂一、血清学判定用抗体类试剂（1）沙门氏菌属诊疗血清（2）志贺氏菌属诊疗血清（3）病原性大肠杆菌诊疗血清诊疗血清制备：制备抗原O抗原，H抗原免疫动物采血测定效价抗血清防腐剂包装诊疗血清使用：玻片上做凝集反应。抗体制药专题知识讲座第52页HBsAg诊疗血清：反向被动血凝试验红细胞甲醛处理吸附抗HBs抗体抗原+抗体红细胞凝集怀孕诊疗试剂：妊娠试验是利用孕妇尿液及血清中含有HCG免疫学特点，检测体内有没有HCG方法。当前临床上应用广泛早早孕诊疗试纸，也称单克隆抗体早孕检测，其原理是应用胶体金标识抗体，加入金标识后，直接在试纸上显示为红色，方便快捷。抗体制药专题知识讲座第53页抗ABO血型系统血清：依据红细胞膜上A、B凝集原和血清内抗A、抗B凝集素不一样，将红细胞血型分为O、A、B、AB四型。抗体制药专题知识讲座第54页二、免疫标识技术用抗体1、荧光抗体诊疗试剂：用荧光色素，如FITC（黄绿色荧光）、罗丹明（亮橙红色荧光）等标识抗体，即为荧光抗体。（1）荧光抗体制备：①抗体准备：加入生理盐水及碳酸盐缓冲液（缓冲液容量为总量1/10），使最终蛋白浓度为20mg/ml，置冰槽中电磁搅拌5～10min。②准备荧光素：每毫克蛋白加0.01mg荧光素。③结合（标识）：边搅拌边将荧光色素渐渐加入球蛋白溶液并继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右。④透析：结合完成后，将球蛋白溶液离心（2500r/min）20min，除去沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。⑤过柱：取透析过夜标识物过G-25或G-50柱，分离游离荧光素，以PBS洗脱，搜集标识荧光抗体进行判定。抗体制药专题知识讲座第55页（2）荧光抗体质量判定：F/P比值测定。F（荧光素）和P（抗体蛋白）克分子比值反应荧光抗体特异性染色质量，普通要求F/P克分子比值为1～2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。抗体制药专题知识讲座第56页（3）免疫荧光测定方法：直接法和间接法。激光共聚焦显微镜检测判定食管癌细胞表示MMP-2，胞浆中绿色荧光为MMP-2，细胞核红色荧光为PI复染。抗体制药专题知识讲座第57页流式细胞仪检测：待测标本制备成单细胞悬液经过荧光染色后进入充满鞘液流动室，鞘液压力与样品流压力是不一样，当二者压力差异到达一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐一经过激光聚焦区。假如咱们将细胞中感兴趣个别特异性标上荧光染料，那麽这些染料将在细胞经过激光检测区时受激光发出特定波长荧光,经过一定波长选择通透性滤色片,咱们可将不一样波长散射光、荧光信号区分开来，并送到不一样光电倍增管中，经过一系列信号转换、放大，数字化处理，咱们就能够在计算机直观统计染上各种荧光染料细胞各自百分率。选择不一样单克隆抗体及荧光染料，咱们能够利用FC同时测定一个细胞上各种不一样特征；假如对含有某种特征细胞有兴趣，咱们还能够利用流式分选功效将其分选出来，方便深入培养、研究。抗体制药专题知识讲座第58页

抗体制药专题知识讲座第59页2、免疫组化抗体诊疗试剂（1）酶标抗体：用酶标识抗体，常见酶为辣根过氧化物酶(HRP)，底物为二氨基联苯胺（DAB），二者作用后生成棕褐色沉淀物。（2）酶标抗体制备：1）原理：HRP经NaIO４氧化后形成醛化酶可与抗体分子氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可深入用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定酶标识抗体。抗体制药专题知识讲座第60页2）步骤：称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配0.1MNaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟；将上述溶液装入透析袋中，对1mMPH4.4醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，再加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRPPH升高到9.0～9.5；马上加入10mgIgG(抗体，或SPA5mg)在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；加0.1ml新配4mg／mlNaBH４液，混匀，再置4℃2小时，最终将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜。抗体制药专题知识讲座第61页肿瘤组织免疫组化图片抗体制药专题知识讲座第62页3、ELISA法抗体诊疗试剂ELISA法原理：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶活性。抗体制药专题知识讲座第63页HBsAg酶标诊疗试剂HBeAg酶标诊疗试剂HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊疗试剂测定HIV抗原酶标抗体试剂甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊疗试剂：诊疗原发性肝癌癌胚抗原（CEA）酶标抗体试剂：诊疗消化道恶性肿瘤改进酶标抗体：抗体+生物素+酶标抗生物素，该系统可起放大作用，灵敏度更高。抗体制药专题知识讲座第64页4、放射免疫用抗体诊疗试剂

氯胺T是对甲苯磺基酰胺N-氯衍生物钠盐，在水溶液中逐步分解形成次氯酸，是一个氧化剂。在偏碱溶液中（pH7.5），氯胺T将125II－氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环氢，形成二碘酪氨酸。抗体制药专题知识讲座第65页放免测定原理：当标识抗原、非标识抗原和特异性抗体三者同时存在于一个反应系统时，因为标识抗原和非标识抗原对特异性抗体含有相同结协力，所以二者相互竞争结合特异性抗体。因为标识抗原与特异性抗体量是固定，故标识抗原抗体复合物形成量就伴随非标识抗原量而改变。非标识抗原量增加，对应地结合较多抗体，从而抑制标识抗原反抗体结合，使标识抗原抗体复合物对应降低，游离标识抗原对应增加，亦即抗原抗体复合物中放射性强度与受检标本中抗原浓度呈反比。抗体制药专题知识讲座第66页

竞争法放免测定原理抗体制药专题知识讲座第67页三、导向诊疗药品放射免疫显像（radioimmunoimaging,RII）是将针对肿瘤相关抗原特异性抗体用放射性核素标识后注入人体，随血液流达肿瘤组织，与肿瘤相关抗原结合，从而使肿瘤组织局部放射性浓聚超出正常组织，然后用体外显像技术取得肿瘤阳性显像图。抗体制药专题知识讲座第68页1、放射免疫显像优点：（1）在体内定位肿瘤准确度高（2）在体内可检出0.5cm大小病灶，并可检测肺、脑等部位转移灶（3）小分子抗体轻易抵达肿瘤部位（4）抗体在肿瘤部位，可保留6~9日（5）能观察抗体在血中半衰期和可能出现不良反应抗体制药专题知识讲座第69页裸鼠乳腺癌组织CEA染色阳性(免疫组化400×)注射131I标识2CEA单抗抗体制药专题知识讲座第70页第六节抗体治疗药品抗体为载体导向治疗药品包含：放射性核素标识抗体治疗药品抗癌药品偶联抗体药品毒素偶联抗体药品抗体制药专题知识讲座第71页毒素偶联抗体药品免疫毒素：毒素和抗体交联物，现在常见免疫毒素为重组免疫毒素。毒素起源：白喉毒素（di