纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理

4.1导言纤维素类生物质是自然界中最丰富。与淀粉在结构上差异仅在于糖苷键连接方式不一样。多与半纤维素、木素相互结合在一起。纤维素酶系统非复合：真菌、放线菌普通由菌丝分泌到胞外分别发挥作用。复合：厌氧菌（热纤梭菌）在其细胞壁上产生隆起细胞结构，为纤维小体。1纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第1页自从1906年在蜗牛消化液中首次发觉纤维素酶后，人类对其研究经历了百年历史：1950--木酶发觉，C1-Cx假说。1980年至1988年--利用基因工程方法对纤维素酶基因进行克隆和一级结构测定。90年代--厌氧细菌纤维小体超分子复合体结构功效研究，多结构与体系发觉。21世纪--基因及氨基酸序列，分子时代。导言2纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第2页4.2纤维素酶系统组成依据各酶功效可分为三大类：(1)内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-Dglucanase,EC.,来自真菌简称EG，来自细菌简称Cen）,这类酶作用于纤维素分子内部非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键,将长链纤维分子截断,产生大量非还原性末端小分子纤维素。(2)外切葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC.1，又称纤维二糖水解酶，来自真菌简称CBH，来自细菌简称Cex。）这类酶作用于纤维素分子非还原端,依次水解β-1,4-糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子。3纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第3页(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC.1,简称BG）,这类酶水解纤维二糖和短链纤维寡糖生成葡萄糖。对纤维二糖和纤维三糖水解很快，伴随葡萄糖聚合度增加水解速度下降。4.2纤维素酶系统组成4纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第4页4.3糖苷水解酶家族以底物专一性为基础建立命名方法不能反应酶分子结构特征。把作用于碳水化合物相关酶类分成许多蛋白质家族，形成专门数据库共享。碳水化合物活性酶(CAZy)分类系统，只对结构域进行定义。CAZy中某一基因结构域以模块表示。5纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第5页6纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第6页7纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第7页图4.28纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第8页4.4厌氧细菌纤维素酶结构与功效厌氧细菌在纤维素底物上生长时，在细胞壁上产生隆起细胞结构即为纤维小体。不一样生物体之间纤维小体结构相同，但其组成成份伴随种不一样而有所差异。纤维小体结构复杂、体积庞大、异质性强。9纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第9页4.4.1纤维小体普通组装模式结构蛋白：初级脚手架蛋白，锚定脚手架蛋白等催化模块：纤维素酶、半纤维素酶等10纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第10页4.4.1纤维小体普通组装模式对接模块粘连模块①②③④11纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第11页4.4.1纤维小体普通组装模式12纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第12页4.4.2粘连模块与对接模块粘连模块不一样厌氧微生物粘连模块序列差异很大。同一个脚手架蛋白上粘连模块普通为同一类型，不一样粘连模块之间有不一样序列相同性。当前型和型粘连模块晶体结构已测定。厌氧细菌纤维素酶结构与功效13纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第13页14纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第14页对接模块由大约具22个氨基酸两条重复序列组成钙离子促使对接模块折叠，并使其形成稳定三级结构。也是粘连模块-对接模块相互作用所必需。对接模块与其对应粘连模块分支情况相对应。厌氧细菌纤维素酶结构与功效15纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第15页16纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第16页粘连模块和对接模块相互作用

决定了纤维小体结构，并纤维小体各亚基整合仅依赖于此。主要以疏水作用相联络，并辅以相对较少分子间氢键。热纤梭菌中Ⅰ型粘连模块与对接模块相互作用是当前已知最强蛋白质间相互作用之一。

厌氧细菌纤维素酶结构与功效17纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第17页粘连模块与酶上对接模块在种内结合是非专一性，而在种间相互作用却是专一性。生化水平上，包含对接模块酶与包含粘连模块脚手架间结合本质上是非特异性。对接过程中粘连模块总体结构本质上不变，对接模块发生了构象改变。粘连模块和对接模块相互作用

18纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第18页图4.4热纤梭菌Ⅰ型粘连模块红色和Ⅰ型对接模块蓝色相互作用示意图19纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第19页4.4.3纤维小体上催化模块以热纤梭菌为例，它现有纤维小体酶系，也有游离非纤维小体酶。区分纤维小体酶与游离酶关键特征是，纤维小体酶带有对接模块。催化模式含有各种情况：热纤梭菌中，表现为葡聚糖内切酶活性、连续降解纤维素内切酶活性、纤维素外切酶。厌氧细菌纤维素酶结构与功效20纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第20页经典纤维小体外切酶（或连续性内切酶）空间结构

厌氧细菌纤维素酶结构与功效21纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第21页厌氧细菌纤维素酶结构与功效经典纤维小体内切酶空间结构

Figure4.4.3Structuralcomparisonof(α/α)6glycosylhydrolases

22纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第22页依据序列和结构相同度，CBM可被分成不一样家族。不一样纤维小体家族中按功效分主要属于A型和B型。脚手架上CBM厌氧细菌纤维素酶结构与功效4.4.4碳水化合物结合模块CBM（carbohydrate-bindingmodule)图4.4热纤梭菌脚手架蛋白上CBM结构示意图脚手架蛋白上往往包含一个CBM，它被认为负责将多酶复合体锚定在对应底物上（即使在瘤胃球菌纤维小体中没有发觉）,其属于A型。热纤梭菌脚手架蛋白CBM三维结构已经被解析其拓扑结构为一个由9个β片层组成果冻卷。23纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第23页酶上CBM不是保持酶复合体靠近底物表面所必需结构。然而其含有潜在功效，似乎是单个酶专一性结合底物，尤其是其在分子水平上结合单个底物分子链（如可溶性β-葡聚糖或木聚糖链）。酶分子模块上CBM现有A型也有B型。厌氧细菌纤维素酶结构与功效酶分子CBM

24纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第24页纤维小体和游离酶上CBM比较

CBM蛋白质种类及其所属家族都是高度不一样。但部分在纤维小体和游离催化系统中是相同。有些只存在于游离催化系统，而在纤维小体中完全不存在。厌氧细菌纤维素酶结构与功效25纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第25页影响小体与底物结合原因弱离子强度能抑制纤维小体结合纤维素。水分子能够从纤维素基质中释放最少部分纤维小体或CBM。适当增加溶液中盐含量可提升纤维小体对底物亲和能力。吸附底物次优条件下，纤维小体复合体酶活力最高。厌氧细菌纤维素酶结构与功效26纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第26页4.4.5纤维小体多样性依据纤维小体上脚手架蛋白数量，能够被分为两类:第一类：解纤维梭菌、食纤维梭菌、约氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、等嗜温梭菌产生纤维小体。只发觉了Ⅰ型粘连模块和对接模块。（6~9个）第二类：热纤梭菌、解纤维醋弧菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维素拟杆菌。复杂程度高。有限资料表明，纤维小体组成和分布会受到碳源影响，另外纤维小体一些结构蛋白和催化组分基因表示也受到生长速率影响。厌氧细菌纤维素酶结构与功效27纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第27页图4.5厌氧细菌纤维素酶结构与功效4.4.5纤维小体多样性28纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第28页厌氧细菌纤维素酶结构与功效4.4.5纤维小体多样性29纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第29页厌氧细菌纤维素酶结构与功效4.4.5纤维小体多样性30纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第30页4.4.6纤维小体基因在基因中分布规律厌氧细菌纤维素酶结构与功效31纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第31页4.4.7微型人造小体研究进展纤维小体实际上是一个微型而高效纤维素降解机器。现在已提出了经过理性人工设计并经过工程伎俩提升天然纤维小体降解活力新思绪。可行性依据：1）对于细菌粘连模块和对接模块，不论是单独生成还是移植到异源性蛋白质上，它们都能忠实地保持本身生物学性质。2）二者高亲和力相互作用在一些产纤维小体细菌种类之间含有物种专一性。厌氧细菌纤维素酶结构与功效32纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第32页与天然纤维小体相比，有三个主要不一样之处：1）含有酶数量有限。2）是同源性。3）每个酶在微型手脚架蛋白上位置是受到控制。未来前景包含构建新杂交手脚架蛋白，使之能够将三个或多个不一样酶结合到特定位点上。嵌合体稳定性也是影响它未来工业化应用一个原因。厌氧细菌纤维素酶结构与功效4.4.7微型人造小体研究进展33纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第33页4.5好氧真菌纤维素酶结构与功效好氧真菌分泌纤维素酶分子普通都由一个糖基化连接肽将一个较大催化结构域和较小纤维素结合结构域连接起来组成。34纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第34页4.5.1催化结构域及催化断键机理纤维素酶催化断键功效相同，但属不一样糖苷水解酶家族。T.reesei是纤维素酶体系研究最为深入好氧真菌。其中CBHI是该菌所产主要外切酶。催化中葡聚糖异头碳构型并不发生改变。水解主要产物是纤维二糖。好氧真菌纤维素酶结构与功效35纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第35页好氧真菌纤维素酶结构与功效4.5.1催化结构域及催化断键机理36纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第36页图4.9好氧真菌纤维素酶结构与功效37纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第37页有待研究问题：1.结晶纤维素表面怎样游离出单根葡聚糖分子链。2.单根葡聚糖链怎样快速准确地进入CBH催化孔道中。

3.葡聚糖链怎样在催化孔道中高效地连续性单方向运动。4.5.1催化结构域及催化断键机理好氧真菌纤维素酶结构与功效38纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第38页4.5.2纤维素结合结构与结构与功效好氧真菌纤维素酶结构与功效当多个不一样蛋白质中都存在一个相同或相同结构域时，该结构域称之为模块。每一纤维素酶分子包含催化模块和碳水化合物模块（CBM）。基于结构和功效，将不一样CBM分成三类：39纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第39页好氧真菌纤维素酶结构与功效4.5.2纤维素结合结构与结构与功效40纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第40页CBM功效推测其功效是将催化结构域拉近到不溶性纤维表面，使纤维素水解过程易于进行。不过其功效及催化中分子机理仍未形成共识。好氧真菌纤维素酶结构与功效4.5.2纤维素结合结构与结构与功效41纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第41页4.5.3链接区结构与功效好氧真菌纤维素酶结构与功效纤维素酶模块结构通常由韧性糖基化连接区连接在一起。其有效长度及柔韧性也是酶催化过程关键。富含脯氨酸、苏氨酸和甘氨酸。42纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第42页4.5.3链接区结构与功效好氧真菌纤维素酶结构与功效即使许多结构域三级结构已得到解析，但当前还没有一个包含完整纤维素酶三维结构取得解析。43纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第43页4.6纤维素酶连续性降解结晶纤维素动态催化过程

结晶纤维素降解是纤维素降解关键限速步骤。连续性作用外切纤维素酶是降解结晶纤维素主要酶类。可分为两个过程：纤维素结晶超分子结构破坏。（需外加能量）糖苷键断裂。（为酶催化反应，是动力学过程）44纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第44页4.6.1纤维素酶分子-底物之间结合过程纤维素酶经过结合结构域吸附到底物上；定位于底物表面上特定化学键上；形成酶-底物复合物；β-糖苷键水解，同时酶分子沿着纤维素链前进；纤维素酶从底物脱吸附，或重复第4步，当催化结构域离开纤维素链时重复第2、3步；β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖形成葡萄糖。

反应过程存在产物抑制，及底物结构改变对酶分子催化过程影响等原因。纤维素酶连续性降解结晶纤维素动态催化过程45纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第45页4.6.2外切纤维素酶对底物分子催化断键过程酶分子-底物复合物待酶分子与底物结合构象改变形成稳定复合物后，催化断键是瞬间发生。普通经过分子动力学/量子力学(MM/QM)，方法进行研究。对外切纤维素酶CBHI分子动力学模拟，CBHI催化孔道与糖链之间有分子间氢键作用，糖分子全部羟基与各种氨基酸残基相互作用，起到稳定酶-底物复合物作用。纤维素酶连续性降解结晶纤维素动态催化过程46纤维素酶类糖苷水解酶和其降解机理第46页共价糖基-酶中间体形成催化循环第一步纤维素酶连续性降解结晶纤维素动态催化过程4.6.2