抗体制药主题知识讲座

抗体制药主题知识讲座抗体制药主题知识讲座第1页2抗体工程药品概念又称抗体药品、单克隆抗体治疗剂、抗体治疗剂。

经过细胞工程或基因工程方法制备，用于治疗单克隆抗体、抗体片段、基因工程改造抗体，以及抗体免疫偶联物或抗体融合蛋白,称为抗体工程药品。抗体制药主题知识讲座第2页3美国FDA已同意治疗抗体药品OrthocloneReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin移植排斥心绞痛B细胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥婴儿呼吸道合胞病毒类风湿关节炎乳腺癌急性复发性髓性白血病难治性慢性淋巴细胞白血病难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤19861994199719971998199819981998抗体制药主题知识讲座第3页4抗体药品主要地位。恶性肿瘤严重威胁大家生命健康，是造成人类死亡主要原因。全球每年有700万人死于肿瘤，且逐年增加。传统肿瘤临床治疗有三种：手术、放疗和化疗。近几年里，以单克隆抗体为基础抗肿瘤导向治疗药品开发领域发生了突飞猛进进展。单克隆抗体药品能特异识别肿瘤细胞，能有效提升药品杀伤力、降低毒副作用。1997年以来，FDA已经同意10种单克隆抗体药品，占有市场全部生物技术药品四分之一。一年综合销售超出10亿美金。

抗体制药主题知识讲座第4页5伴随生物技术发展，单克隆抗体在疾病治疗方面作用越来越受到大家重视。在同种异体免疫排斥、本身免疫反应抑制、抗血小板治疗、癌症治疗、感染性疾病治疗等方面应用最为广泛。当前全球从事人源化单克隆抗体开发企业260家左右，研究中产品达700多个，其中进入临床阶段约100个，预计占研制中生物技术药品25%。据美国制药工业协会调查汇报显示，单克隆抗体药品居全部医药生物技术产品之首。抗体制药主题知识讲座第5页6年底，在美国药品市场上生物技术药品有76种，其中抗体药品有15种；正处于临床研究阶段369种生物技术药品中，抗体药品有70种。

中国已经有2个治疗性单抗产品获准生产，3个治疗性产品处于临床试验阶段，多个抗体药品处于临床前研究阶段，已同意诊疗性单抗有31个。抗体制药主题知识讲座第6页7抗体分子应用抗体分子是生物学和医学领域用途最为广泛蛋白分子。以肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原、抗体独特型决定簇、细胞因子及其受体、激素及一些癌基因产物等均作为靶分子，利用传统免疫方法或经过细胞工程、基因工程等技术制备多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体广泛应用在疾病诊疗、治疗及科学研究等领域。完整鼠源抗体轻易引发机体排异反应，而基因工程抗体因为分子量小，经过改造能够降低鼠源性，所以是生物技术制药领域研究重点和热点。抗体制药主题知识讲座第7页8当前正在进行开发和已经投入市场抗体性药品主要有以下几个用途：

1．器官移植排斥反应逆转；

2．肿瘤免疫诊疗；

3．肿瘤免疫显像；

4．肿瘤导向治疗；

5．哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其它本身免疫性疾病；

6．抗独特型抗体作为分子瘤苗治疗肿瘤；

7．多功效抗体（双特异抗体、三特异抗体、抗体细胞因子融合蛋白、抗体酶等）特殊用途。

抗体制药主题知识讲座第8页9依据美国药品研究和生产者协会（PhRMA）调查汇报，癌症是威胁人类健康主要疾病之一，预防和治疗癌症是研究和开发抗体药品主要目标之一。最初抗体主要被用于肿瘤体外免疫诊疗和体内免疫显像，伴随抗体工程技术不停进步，多年来大家将更多目光集中在治疗肿瘤抗体药品开发上。第一个被美国同意用于人肿瘤治疗基因工程抗体－Rituxan（r）最初被用于非何杰金氏淋巴瘤，总有效率达60％，现在正在探索用于治疗艾滋病相关淋巴瘤和中枢神经系统淋巴瘤。

抗体制药主题知识讲座第9页10当前在临床中使用肿瘤治疗药品多数存在“敌我不分”问题，即在杀死肿瘤细胞同时，也破坏了人体正常细胞。“生物导弹”为处理这个难题提供了一个理想思绪。“生物导弹”，即将各种毒素、放射性同位素、化疗药品与识别肿瘤特异抗原或偶联肿瘤相关抗原后，能够特异杀伤肿瘤细胞一类药品。这种药品经由静脉注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又降低对机体毒副作用。放射性同位素与抗体偶联物在体内能将前者运至药靶部位，并经过其放射性活性杀伤靶细胞，还可经过X射线摄影机拍摄核素放射线图像，用于体内治疗和定位诊疗。抗体制药主题知识讲座第10页11抗体与化疗药品分子偶联方法普通采取化学法。这些偶联物对结肠癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、肺癌、骨肉瘤等有一定抗癌效应。抗体与生物毒素交联制备偶联物称为免疫毒素。免疫毒素抗体个别对对应抗原有特异识别作用，及免疫毒素个别含有对细胞毒作用，对肿瘤细胞含有杀伤效应，是很有潜力免疫治疗方法。抗体制药主题知识讲座第11页12抗肿瘤血管生成抗体治疗肿瘤研究最近也取得了很大进展。在动物模型中用抗血管生成因子、抗体封闭血管内皮生长因子取得了抑制肿瘤生长作用；抗癌基因产物抗体Herceptin（r）作为生物技术药品已经在美国上市，配合化疗用于乳腺癌和卵巢癌治疗，并取得很好疗效。抗体制药主题知识讲座第12页131．单克隆抗体（McAb）抗体作为免疫治疗生物制剂，在临床应用已经有一个世纪。以前抗体主要来自于经抗原免疫异种动物（如马）血清。淋巴细胞杂交瘤技术，能够大量制备针对任何抗原决定基单克隆抗体。抗体制药主题知识讲座第13页14抗T细胞及其亚类抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体，它们在移植排斥及一些本身免疫病应用中，已取得了显著疗效。抗各种细胞表面分子单克隆抗体，如抗IL-2受体单克隆抗体，抗粘附分子单克隆抗体都有显著免疫调整作用，在本身免疫病治疗，预防肿瘤转移等方面都有主要使用潜力。抗体制药主题知识讲座第14页15单克隆抗体另一主要应用是肿瘤诊疗及分型。在过去10多年来，抗各种人肿瘤相关抗原单克隆抗体得到了广泛研究。针对各种人肿瘤细胞单克隆抗体都能较特异地识别肿瘤细胞，而基础上不与正常组织起反应。抗肿瘤单克隆抗体在肿瘤诊疗及分型方面是一个有用工具；但在肿瘤治疗上，因为大多抗肿瘤单克隆抗体不能直接杀伤肿瘤细胞，所以单独应用肿瘤没有显著效果。抗体制药主题知识讲座第15页162．导向药品（targeteddrug）利用抗肿瘤单克隆抗体特异识别肿瘤细胞特点，将它作为导向载体与各种杀伤分子，如毒素、抗癌药品、放射性核素等，进行化学交联，能够构建成一个对肿瘤细胞含有高度特异强杀伤活性杂交分子，称为导向药品。抗体制药主题知识讲座第16页17抗肿瘤单抗与毒素交联物又称免疫毒素(IT)。用于制备IT毒素主要有：①植物毒蛋白这类毒素主要有篦麻毒素（ricin）、相思子毒素（abrin）以及苦瓜毒素（mormordin）、商陆抗病毒蛋白（PAP）、天花粉蛋白等。它们都能够经过灭活核糖体，阻断蛋白质合成，杀伤靶细胞。。抗体制药主题知识讲座第17页18②细胞毒素主要有白喉外毒素（DT），绿脓杆菌外毒素（PE）等。它们主要经过抑制延长因子-2阻断蛋白质合成，杀死靶细胞。上述这些毒素都含有极强毒性，1个分子篦麻毒素进入细胞，就足以杀死该细胞抗体制药主题知识讲座第18页19抗肿瘤单克隆抗体与抗癌药品交联物，又称免疫交联物(immunoconjugate)。用以制备这类导向药品抗癌药品主要有阿霉素（adriamycin）、氨甲蝶呤（MTX）等。它们主要经过阻断DNA合成来杀死靶细胞。抗癌药品杀细胞作用比毒素低得多，增加抗体分子携带药品分子数，能够增强其杀伤活性，但常会造成抗体活性下降与丧失。这类导向药品优点是分子较小，同时如有非特异杀伤不会有严重后果。缺点：杀伤力不高，临床应用前景不被看好。抗体制药主题知识讲座第19页20Ⅰ、放射性免疫交联物可用于肿瘤诊疗。与肿瘤细胞结合放射性免疫交联物放出γ射线，能够用γ照像机摄像，取得清楚肿瘤显像。此技术称为放射免疫显像。Ⅱ、放射性免疫交联物也可用于肿瘤治疗。标识了大量高能核素抗肿瘤单克隆抗体与肿瘤细胞结合后，能够经过辐射损伤杀死靶细胞及其周围肿瘤细胞。此技术又称为放射免疫治疗。用于与抗肿瘤单克隆抗体交联放射性核素主要有125Ⅰ、131Ⅰ、111In等。抗体制药主题知识讲座第20页21（四）肿瘤疫苗肿瘤疫苗与传统疫苗在概念上不一样，它主要不是用于肿瘤预防，而是经过瘤苗接种来刺激机体对肿瘤免疫应答来治疗肿瘤。因为人肿瘤相关抗原免疫原性很弱，不足以有效地刺激机体免疫应答，所以单纯用本身或同种肿瘤细胞作瘤苗治疗肿瘤效果不好。用肿瘤细胞卡介苗等佐剂联合应用，能提升免疫应答效果，在一些晚期肿瘤患者取得了一定治疗效果。抗体制药主题知识讲座第21页22肿瘤疫苗主要有二类：第一类对肿瘤抗原表位性质研究，造成了肿瘤分子疫苗产生。含有肿瘤抗原决定基肽疫苗和多糖疫苗已在研制，有已在临床试用。第二类，确定了抗肿瘤免疫应答主要效应细胞是TC细胞，造成了基因转染肿瘤细胞疫苗出现。抗体制药主题知识讲座第22页23TC细胞识别肿瘤表面肽抗原（peptide）与MHCⅠ类分子复合物，必需要有第二信号才能活化。这个第二信号能够由TC细胞表面CD28分子与粘附分子B7结合来提供。（B7分子主要存在于活化B细胞和抗原呈递细胞表面。）在通常性况下，肿瘤细胞合成胞内抗原经胞内降解、处理后，形成肿瘤肽抗原与MHCⅠ类分子结合复合物，共表示于瘤细胞表面。抗体制药主题知识讲座第23页24大多数肿瘤细胞因为没有B7分子，所以肿瘤细胞虽含有肽抗原与MHCⅠ类分子复合物，但因为不能提供第二信号，所以不能活化TC细胞。IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ等基因转染肿瘤细胞本身能够分泌细胞因子，造成抗肿瘤免疫应答产生。试验研究发觉，接种了工程化肿瘤细胞后，原先已生长亲本野生型肿瘤细胞开始消退；而且以后再接种野生型肿瘤细胞也不再生长，这说明工程化肿瘤细胞含有经典抗肿瘤疫苗效应。有意义是，用放射线将这种工程瘤苗杀伤死后，依然能够取得相同抗肿瘤效果。抗体制药主题知识讲座第24页25免疫网络学说提出

这一学说是Jerne（1972）依据当代免疫学反抗体分子独特型认识而提出。这一学说认为在抗原刺激发生之前，机体处于一个相正确免疫稳定状态，当抗原进入机体后打破了这种平衡，造成了特异抗体分子产生，当到达一定量时将引发抗Ig分子独特型免疫应答，即抗体产生。抗体制药主题知识讲座第25页26抗体分子在识别抗原同时，也能被其它抗体分子所识别。在同一动物体内一组抗体分子上独特型决定簇可被另一组抗独特型抗体分子所识别。而一组淋巴细胞表面抗原受体分子亦可被另一组淋巴细胞表面抗独特型抗体分子所识别。这么在体内就形成了淋巴细胞与抗体分子所组成网络结构。网络学说认为：这种抗体产生在免疫应答调整中起着主要作用。使受抗原刺激增殖克隆受到抑制，而不至于无休止地进行增殖，藉以维持免疫应答稳定平衡。

抗体制药主题知识讲座第26页27抗体药品特异性特异性与相关抗原特异性结合对肿瘤等靶细胞选择性杀伤作用多样性抗原多样性抗体结构多样性抗体活性多样性免疫偶联物多样性制备时定向性针对特定靶分子定向制备抗体药品依据需要选择抗体药品“效应分子”抗体制药主题知识讲座第27页28单克隆抗体针对特定单一抗原表位，含有高度特异性，这是抗体药品发挥治疗作用主要基础。单克隆抗体技术由英国剑桥科学家米尔斯坦（Milstein）和科勒（Kohler）于1975年首度研制。单抗作为治疗剂研究经历了比较波折发展过程，上个世纪80年代迅猛发展；90年代早期又一度处于低谷；多年再度成为生物技术药品领域研究热点。当前，单抗药品品种数量位居前列。抗体制药主题知识讲座第28页29单抗药品含有以下主要特点：其一，特异性。单抗针对特定单一抗原表位，含有高度特异性，这是单抗药品发挥治疗作用主要基础。对于抗肿瘤抗体药品研究表明，其特异性主要表现为特异性结合、选择性杀伤、体内靶向性分布以及含有更强疗效。其二，多样性。主要表现在抗原多样性、抗体结构多样性，作用机理多样性等方面。抗体制药主题知识讲座第29页30其三，制备单抗药品定向性。单抗药品主要特点之一是能够定向制造。即依据需要，能够制备含有不一样治疗作用单抗药品。能够针对特定靶分子，定向制备对应抗体；也能够依据需要选择对应“效应分子”，制备对应免疫偶联物或融合蛋白。抗体制药主题知识讲座第30页31抗体工程发展简史多克隆抗体阶段，早在1890年，培林(vonBehring)和北里(Kitasato)，就在试验室制造出抗白喉杆菌外毒素血清用于治疗白喉。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出均一性单克隆抗体，叫细胞工程抗体。在80年代初，抗体基因结构和功效研究结果与重组DNA技术相结合，产生了基因工程抗体技术，1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生。1994年，Winter等人抗体库技术：噬菌体抗体库技术；核糖体展示抗体库技术。抗体制药主题知识讲座第31页32抗体工程发展历程抗体作为疾病预防、诊疗和治疗制剂已经有上百年发展历史。早期制备抗体方法是将某种天然抗原经各种路径免疫动物，成熟B细胞克隆受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中抗体是各种单克隆抗体混合物，所以称之为多克隆抗体。多克隆抗体是人类有目标利用抗体第一步。多克隆抗体不均一性，限制了反抗体结构和功效深入研究和应用。抗体制药主题知识讲座第32页33这种单克隆抗体多是由鼠B细胞与鼠骨髓瘤细胞经细胞融合形成杂交瘤细胞分泌，含有鼠源性，进入人体会引发机体排异反应；完整抗体分子分子量较大，在体内穿透血管能力较差；生产成本太高，不适合大规模工业化生产。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出均一性单克隆抗体。杂交瘤单克隆抗体又称细胞工程抗体。杂交瘤技术诞生被认为是抗体工程发展第一次质飞跃，也是当代生物技术发展一个里程碑。

抗体制药主题知识讲座第33页34基因工程抗体优点：1．经过基因工程技术改造，能够降低甚至消除人体反抗体排斥反应；

2．基因工程抗体分子量较小，能够个别降低抗体鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶关键部位；

3．依据治疗需要，制备新型抗体；

4．能够采取原核细胞、真核细胞和植物等各种表示方式，大量表示抗体分子，大大降低生产成本。

抗体制药主题知识讲座第34页35自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不停出现。如人源化抗体、单价小分子抗体（Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等）、多价小分子抗体（双链抗体，三链抗体，微型抗体）、一些特殊类型抗体（双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫粘连素）等。用于构建基因工程抗体抗体基因最初起源于杂交瘤细胞，所以一样必须经过动物免疫，细胞融合及克隆筛选这么一个长久、复杂工艺流程；依然不能制备针对稀有抗原抗体和人源性抗体，无法改进抗体亲和力。抗体制药主题知识讲座第35页36这些缺点限制了基因工程抗体更为广泛应用。噬菌体抗体库是应用最为普遍抗体库技术。采取噬菌体抗体库技术筛选抗体无须进行动物免疫，易于制备稀有抗原抗体、筛选全人源性抗体和高亲和力抗体。抗体制药主题知识讲座第36页37噬菌体抗体库技术是生命科学研究突破性进展之一，同时也将抗体工程研究推想了一个新高潮。在噬菌体抗体库基础上，近几年又发展了核糖体展示抗体库技术。利用核糖体展示技术筛选抗体整个过程均在体外进行，不经过大肠杆菌转化步骤，所以能够构建高容量、高质量抗体库，更易于筛选高亲和力抗体和采取体外进化方法反抗体性质进行改造。核糖体展示抗体库技术代表了抗体工程未来发展趋势。

抗体制药主题知识讲座第37页抗体抗体制药主题知识讲座第38页39抗体概念定义一：抗原诱导由淋巴细胞合成和分泌，含有特殊氨基酸序列和结构免疫球蛋白分子(lg)。定义二：能与对应抗原特异性结合含有免疫功效球蛋白。抗体制药主题知识讲座第39页40人体中主要抗体及性质©byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.抗体制药主题知识讲座第40页41抗原

抗体由抗原诱导产生，抗原是抗体药品靶分子。抗体所针正确抗原可包含：半抗原。蛋白如糖蛋白或脂蛋白。多糖如脂多糖。人体疾病相关基因及其编码蛋白。各种病原体如病毒、支原体、细菌、原虫、寄生虫。抗体制药主题知识讲座第41页42抗体主要作用结合抗原中和毒素促进吞噬功效抗体制药主题知识讲座第42页43结合抗原和中和毒素©byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.抗体制药主题知识讲座第43页44促进吞噬功效抗体制药主题知识讲座第44页45自然界中可作为抗原物质数不胜数，机体中可产生大量抗体来对付各种抗原，每个浆细胞每秒钟可分泌多个抗体，免疫蛋白占血浆总蛋白20％，是血液中丰度最高蛋白。抗体制药主题知识讲座第45页46抗体结构©byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.抗体制药主题知识讲座第46页47Lg分子是由二硫键连接起来约4条（2对）多肽链组成，长一对称为重链H，有450-570个Aa残基，短一对称为轻链L，约有214个Aa残基。抗体制药主题知识讲座第47页48抗体多样性-抗体编码基因较多SourcesfromMolecularCellBiology

9.MolecularStructureofGenesandChromosomes

9.4.FunctionalRearrangementsinChromosomalDNA轻链L编码区由V、J和C区组成，其中V、J组成可变区抗体制药主题知识讲座第48页49抗体多样性SourcesfromMolecularCellBiology

9.MolecularStructureofGenesandChromosomes

9.4.FunctionalRearrangementsinChromosomalDNA重链H编码区由V、D、J和C区组成，其中V、D、J组成可变区抗体制药主题知识讲座第49页50抗体多样性Lg分子氨基端L链1／2与H链1／4区段氨基端组成及排列次序多变，称为可变区（V区）。Lg分子氨基端L链1／2与H链3／4区段氨基端组成及排列比较恒定，称为恒定区（C区）。可变区中互补决定区CDR

含有很大变异性，而恒定区中FR

保守。FR1FR2FR3CDR1CDR2CDR3H2NCOOH抗体制药主题知识讲座第50页51抗体多样性

SourcesfromMolecularBiologyoftheCell

V.CellsinTheirSocialContext

24.TheAdaptiveImmuneSystem

BCellsandAntibodies恒定区FR

保守恒定区抗体制药主题知识讲座第51页52抗体独特征编码重链和轻链基因重排后，进行表示生成细胞表面受体并能与抗原发生作用。只有这些Bcell表示表面Lg与一个外源抗原结合后才会引发深入反应。在这些识别过程中将本身抗原识别掉排除。识别外源抗原Bcell被诱导增殖并分泌抗体，在此过程中，可变结构域CDR特定部位被诱导发生随机突变，Bcell在反向于那些与抗原有高亲和力突变抗体分泌。这个过程非常高效，使免疫系统含有产生反抗任何外来分子抗体能力。可变区这种独特装配方式叫做抗体独特征。抗体制药主题知识讲座第52页53抗体多样性体细胞突变，B细胞分化过程中点突变可重复进行，使分化中B细胞受抗原压力选择。体细胞内重组。基因转换。核苷酸掺入。

抗体制药主题知识讲座第53页54

©byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter抗体多样性－其它机制抗体制药主题知识讲座第54页杂交瘤技术和单克隆抗体抗体制药主题知识讲座第55页56单克隆抗体概念杂交细胞：在诱导物作用下同一细胞或不一样细胞间融合，融合细胞含有双亲本细胞染色体和全部或个别特征。杂交瘤细胞：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后产生杂交细胞。单克隆抗体：含有分泌抗体能力B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞经无性繁殖形成细胞系分泌产生活性、亲和力均相同抗体。抗体制药主题知识讲座第56页57单克隆抗体特点多克隆抗体不足：假阳性、制备困难、产量低。单抗中抗体分子在Aa序列和空间构型上均相同。单抗含有高度特异性。产生单抗细胞系可长久传代并保留，可连续生产同一性质抗体。抗体制药主题知识讲座第57页58制备针对特异抗原单克隆抗体制备抗原凡含有抗原性物质均可免疫时抗原纯度可不高纯度高抗原利于以后筛选骨髓瘤细胞常见骨髓瘤细胞系小鼠BALB/c细胞系大鼠Lou细胞系免疫动物应与骨髓瘤细胞供体相一致抗体制药主题知识讲座第58页59制备针对特异抗原单克隆抗体普通选40-50%PEG进行诱导。细胞融合后培养液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等细胞。常见选择性培养基为HAT培养基。抗体制药主题知识讲座第59页60制备针对特异抗原单克隆抗体将经融合混合细胞用HAT培养液悬浮稀释。普通在含有喂养细胞96孔板中进行。在融合后7d用HAT选择培养基培养，7-14d用HT培养基培养，14d后用完全培养基培养。抗体制药主题知识讲座第60页61制备针对特异抗原单克隆抗体选择培养后，只有杂交瘤细胞才能生存。但不是全部杂交瘤细胞均能产生所需抗体。产生特定抗原抗体B细胞只占全部脾细胞5％左右。用抗原对全部小孔培养上清进行抗体检测，筛出能产生目标抗体杂交瘤细胞。抗体制药主题知识讲座第61页62制备针对特异抗原单克隆抗体将能产生目标抗体培养小孔中杂交瘤细胞进行稀释。可用有限稀释法和软琼脂法。有效稀释时，将细胞稀释液分加到96孔板中，使每个小孔在理论上只有一个细胞。软琼脂法。抗体制药主题知识讲座第62页63制备针对特异抗原单克隆抗体培养后，取上清进行抗体检测，取得能产生目标抗体杂交瘤细胞系。大量生产目标单克隆抗体。体外培养法，10μg/ml。动物体内诱生法，5-20mg/ml。抗体制药主题知识讲座第63页64小结1.用特定抗原免疫动物2.从脾中取出B淋巴细胞2.骨髓瘤细胞3.取得杂交瘤细胞4.培养并筛选能产生抗体单个杂交瘤细胞5.优化培养目标杂交瘤细胞6.纯化单克隆抗体抗体制药主题知识讲座第64页65单克隆抗体不足当前单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（humanantimouseantibody,HAMA)人体排斥反应人体内半衰期只有5-6小时抵达靶组织药量仅有1％完整抗体分子相对分子量较大，穿透力不强，难以抵达病灶关键部位抗体制药主题知识讲座第65页基因工程抗体抗体制药主题知识讲座第66页67基因工程改造抗体目标降低免疫原性。降低相对分子量，增加穿透力。抗体制药主题知识讲座第67页68人－鼠嵌合抗体(human-mousechimericantibody)在基因水平上将鼠源性单克隆抗体可变区和人源性抗体恒定区连接起来，并在适当宿主细胞中表示形成抗体。抗体制药主题知识讲座第68页69人－鼠嵌合抗体鼠源性鼠源性人源性人源性抗体制药主题知识讲座第69页70人－鼠嵌合抗体构建能产生目标抗体杂交瘤细胞系mRNAcDNA依据VL和VH基因两端序列设计引物PCR扩增VH基因VL基因连人IgCH基因连人IgCL基因等量混合后，经过脂质体介导共转染骨髓瘤细胞SP2/0,筛选取得共转染细胞抗体制药主题知识讲座第70页71人－鼠嵌合抗体不足

即使人－鼠嵌合抗体与鼠源性抗体相比，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍不能完全消除。抗体制药主题知识讲座第71页72抗体CDR区

SourcesfromMolecularBiologyoftheCell

V.CellsinTheirSocialContext

24.TheAdaptiveImmuneSystem

BCellsandAntibodies框架区框架区CDR抗体制药主题知识讲座第72页73

改形抗体又叫CDR移植抗体。将鼠单抗CDR移植到人Ig分子骨架区中，换下其CDR序列而形成抗体。改形抗体(reshapedantibody)抗体制药主题知识讲座第73页74含有鼠源性单克隆抗体抗原结合特异性。抗体分子中鼠源个别只占很小百分比，可基础消除免疫原性。到当前，约有100种鼠单抗经过CDR移植取得人源化改形抗体，其中超出40种已进行或正在进行临床试验。改形抗体特点抗体制药主题知识讲座第74页75构建改形抗体除较复杂、费时费劲外，最大问题是人Ig分子框架区中一些氨基酸与鼠单抗CDR区不协调，从而使改形抗体亲和力下降，甚至丧失活性。改形抗体不足抗体制药主题知识讲座第75页76在人－鼠嵌合抗体基础上，未来自鼠单抗可变区中决定免疫原性暴露于抗体表面Aa，用对应位置人IgAa代替而形成抗体。镶面抗体（resurfacingantibody）抗体制药主题知识讲座第76页771991年，Padlan等分析了大量鼠单抗可变区Aa和人抗体可变区Aa表面暴露情况，发觉抗体表面所暴露Aa位置和数量都很保守，不因种属和型别而改变。抗体表面暴露Aa是鼠源可变区免疫源性主要起源。镶面抗体理论基础抗体制药主题知识讲座第77页78FcFdFabFv小分子抗体抗体制药主题知识讲座第78页79Fab片段和重组Fab片段Fab片段由重链Fd段和完整轻链经过链间二硫键形成异二聚体，整个分子约占整个抗体分子1/3。假如Fab片段恒定区为人源性，则称为重组Fab片段。S－SVLCLVHCH抗体制药主题知识讲座第79页80小分子抗体－抗体片段化Fab:Fragmentationofantigenbinding胃蛋白酶木瓜蛋白酶抗体制药主题知识讲座第80页81Fv和单链抗体(single-chainFv,scFv)Fv片段由重链可变区VH段和轻链可变区VL经过非共价键结合在一起，是抗体中含有抗原结合活性最小功效片段。scFv是指在DNA水平上用一段长度适当寡核苷酸序列将重链可变区和轻链可变区连接起来，形成单一链分子。VLVHVLVHVLVH抗体制药主题知识讲座第81页82双体分子(diabody)

一条单链抗体分子上VH和VL与另一条相同单链抗体分子上VL和VH分别配对形成双价抗体分子。VLVHVHVL抗体制药主题知识讲座第82页83单域抗体

比Fv更小亚单位结构组成含有抗原结合活性分子，重链可变区是经典单域抗体，其含有较高抗原结合活性。VH抗体制药主题知识讲座第83页84最小识别单位比单域抗体更小分子，如CDR3仍能与抗原结合，只是其亲和力相当低。CDR3抗体制药主题知识讲座第84页85小分子抗体优点分子质量小，免疫原性低。易于进入实体瘤周围微循环甚至进入实体瘤内部。无Fc片段，不易与含有Fc受体非靶细胞结合，用于免疫诊疗时成像清楚。构建较简单，易于操作和改造。可在细菌中表示，易于大量生产。可与各种效应分子如毒素、前体药品转化酶等构建各种双功效抗体分子。抗体制药主题知识讲座第85页86小分子抗体缺点多为单价抗体，与抗原结合活性相对较弱。半衰期短，能很快从血液中去除，从而可能影响治疗有效浓度。抗体制药主题知识讲座第86页87抗体库技术(antibodylibrary)用基因克隆技术克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，然后重组到特定表示载体中，转化特定宿主细胞表示有功效抗体分子，并经过亲和筛选取得特异性抗体可变区基因技术。利用抗体库技术筛选到抗体可变区基因可被用于