微生物综合实验

微生物学综合试验（二）第一阶段：分组---选题---制订试验方案第二阶段：菌株筛选---分离纯化---菌落形态观察第三阶段：菌株保藏----个体形态----生理生化特征第四阶段：分子判定----生物信息学分析微生物综合实验第1页第一阶段：分组---选题---制订试验方案1、海洋琼胶降解细菌筛选、分离与系统判定可供选择题目：2、产纤维素酶海洋细菌分离与系统判定3、产淀粉酶海洋细菌分离与系统判定4、产色素海洋细菌分离与系统判定5、海藻附生细菌分离与系统判定6、海洋生物附生菌分离与系统判定微生物综合实验第2页第一阶段：分组---选题---制订试验方案假如愿意进行基因克隆表示等微生物分子生物学试验，也能够安排；可供选择题目：

题目亦可自拟，但需要指导教师同意；微生物综合实验第3页第一阶段：分组---选题---制订试验方案1、每个小组4-5人，自由组合，名单与每个人联络方式发指导教师邮箱；2、分组、选题之后，制订菌株筛选方法，请指导教师确定；3、第一阶段3月23号-27号，3月28号进试验室准备培养基。微生物综合实验第4页第二阶段：菌株筛选---分离纯化---菌落形态观察1、3月28号（第6周）准备培养基、生理盐水等；倒平板、取样、涂布平板、培养；每个组40个平板2、4月1号，观察结果，分离挑取菌株，或重复筛选；菌株划线分离，培养；3、4月11号（第8周周一），完成菌株筛选和菌落形态描述，每人选定一株细菌，提供菌落照片一张；微生物综合实验第5页海洋细菌特点：1、生长温度低：近海细菌培养温度普通用25-28℃；2、需盐：最适生长盐度普通在2%-3%，部分菌株必须依赖海水或人工海水才能生长。微生物综合实验第6页海洋细菌惯用培养基：2216E海洋细菌培养基(Zobell，1941)2216MarineAgar,2216MarineBroth2216E培养基配方（固体培养基）

蛋白胨5克酵母膏1克

磷酸高铁0.01克琼脂15---20克

陈海水1000毫升

氢氧化纳（5%）溶液调PH值7.6微生物综合实验第7页样品采集采泥器：适合用于采集海洋、河流、湖泊、水产养殖场等水底表层泥样泥样采集微生物综合实验第8页南森采水器：能够采取海洋不一样深度若干个水样，同时测定各水样所在水层水温。水样采集微生物综合实验第9页装有海水样品离心管在超净工作台中处理将采集样品装于灭菌离心管中，在尽可能短时间内进行处理（无菌条件下）。→微生物综合实验第10页选择适当培养基培养基选择标准：有针对性提供营养物质，如产纤维素酶菌分离，鉴于菌株能够利用纤维素为碳源，所以需要加入羧甲基纤维素钠，培养后用刚果红染色。微生物综合实验第11页菌种分离纯化1.分离：用无菌生理盐水对样品进行梯度稀释，在对应培养基上利用平板涂布法对样品涂布，放置在适当温度下培养（海洋菌28℃）2.纯化：待平板上有显著菌落生长，挑取单个菌落进行划线分离培养，直至纯化。微生物综合实验第12页平板分区划线分离法（左）及培养后菌落分布示意图（右）

微生物综合实验第13页形态观察：菌落形态观察与描述：每人提供一张带有单菌落划线分离培养固体平板数字化照片；勉励另外提供能够显示菌株特点照片。4月11号之前发指导教师邮箱。微生物综合实验第14页形态观察：1、菌株编号：QM272、培养基：海洋细菌2216E3、培养时间：48h4、菌落形态描述：菌落圆形、光滑、湿润、边缘整齐、奶油色、直径3-5mm、微生物综合实验第15页形态观察：显示菌株特点照片（需附说明）：细菌QM38在海洋细菌2216E平板上生长96h，因为分泌胞外琼胶酶，琼脂降解，造成平板液化。微生物综合实验第16页形态观察：显示菌株特点照片（需附说明）：利用卢戈氏碘液对琼胶降解细菌进行筛选，能够产生胞外琼胶酶菌株，其菌落周围有着色浅透明区域。微生物综合实验第17页第三阶段：菌株保藏---个体形态---生理生化特征菌株保藏：初定于4月13号---17号菌株保藏1、海洋细菌菌种是主要海洋微生物资源；2、学习菌株保藏相关理论知识；3、利用-80℃超低温冰箱冷冻保藏菌株。4、详细保藏步骤介绍。微生物综合实验第18页甘油冷冻保藏法原理：加入保护剂：丙三醇，-70~-80℃保留。步骤：★保种液配方：1%Nacl,15%丙三醇，85%水→灭菌★将纯化后菌种在普通斜面上进行划线★加入保种液，将菌洗脱★加入灭过菌菌种保留管中→超低温冰箱保留微生物综合实验第19页画蛇形线菌种保留管微生物综合实验第20页第三阶段：菌株保藏---个体形态---生理生化特征个体形态观察：4月11号-----1、个体形态与大小；2、革兰氏染色；3、芽胞染色、鞭毛染色。

微生物综合实验第21页第三阶段：菌株保藏---个体形态---生理生化特征生理生化特征：1、生长温度试验；生长盐度试验；2、TCBS培养基生长试验；3、氧化酶、过氧化氢酶试验；4、API试剂条进行快速生理生化特征测定微生物综合实验第22页温度试验用接种环挑取新鲜细菌培养物于4ml无菌水中稀释，取20ul滴于2216E平板上，分别放在5℃、15℃、28℃、37℃、42℃恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况。培养时间依温度而异，5℃、15℃培养一周；37℃、42℃培养两天。微生物综合实验第23页盐度试验用不一样浓度NaCl溶液代替陈海水，配制不一样NaCl浓度培养基。挑取培养了48h新鲜菌落于4ml无菌水中稀释后，取20ul滴于0，1，3，5，7，9%NaCl浓度培养基上，28℃培养72h，观察菌落生长情况。培养基由指导教师统一提供微生物综合实验第24页TCBS生长试验TCBS培养基是一个弧菌判别性培养基，菌落普通呈绿色、黄绿色和黄色等颜色，原因是有些菌能够利用培养基中蔗糖产酸，使培养基pH值降低，指示剂变黄色，而不能利用蔗糖弧菌菌落仍展现绿色。有时伴随培养时间延长，黄色菌落颜色也会发生改变，变成浅绿色或绿色，这主要也是因为培养基pH改变造成。培养基由指导教师统一提供，或指定一个小组准备。微生物综合实验第25页鉴于部分生理生化试验培养基配置要求较高，且不易观察试验结果。所以部分试验采取API试剂条进行。微生物综合实验第26页API判定系统API是AnalyticProductsINC简称。API判定系统是由法国生物一梅里埃企业生产细菌数值分类分析判定系统。该系统品种齐全，包含范围广，判定能力强，数据库在不停地完善和补充，当前约有1000种生化反应，可判定细菌大于550种。是世界范围内应用最广、种类最多、最受微生物学家推崇国际标准化产品。微生物综合实验第27页API组成API判定系统主要部分是API试剂条及检索工具另外有些反应还需使用添加试剂。微生物综合实验第28页①发酵试验：为碳水化合物与酸分解代谢试验，结果是经过PH改变引发酸碱指示剂颜色改变来判断。如葡萄糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、山梨醇等。微生物综合实验第29页②同化试验：依据待测菌能否利用反应杯中单一碳水化合物作为碳源而得以生长来判断。如葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N一乙酰葡糖铵、葵酸、乙二酸、苹果酸等。微生物综合实验第30页③酶试验：依据待测菌含有对应酶就可分解底物，再经过显色反应来判断。如碱性磷酸酶、氧化酶、β二分之一乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、吲哚产生等。微生物综合实验第31页④其它生化反应：如硝酸盐还原酶、七叶苷、明胶、硝酸盐还原等。微生物综合实验第32页API种类依据用途不一样，API分为14种：API20E、API20NE、API20STREP、APICAMPY、APISTAPH、APINH、API20CAUX、APICandida、API20A、APICORYNE、API10S、RAPID20E、APILISTERIA、

APIZYM、API50CH{API50CHB、API50CHL、API50CHE}微生物综合实验第33页API种类判定细菌API20E肠杆菌和其它非苛养革兰氏阴性杆菌RapiD20E肠杆菌API10S

肠杆菌和其它非苛养革兰氏阴性杆菌API20NE

非肠道和非苛养革兰氏阴性杆菌APIStaph

葡萄球菌，考克氏菌和微球菌属API20Strep

链球菌APICoryne

棒状杆菌APIListeria

李斯特氏菌微生物综合实验第34页API种类判定细菌APICandida

酵母菌API20CAUX

酵母菌API20A

厌氧菌APICampy

弯曲杆菌APINH

奈瑟氏球菌，嗜血杆菌和卡他布兰汉菌APIZYM半定量检测酶活性API50CHAPI50CHB/E

肠杆菌科、芽孢杆菌API50CHAPI50CHL

乳酸杆菌微生物综合实验第35页API20E- 肠道杆菌科於环境中及动物产品中非常普遍其中部份是致病性(沙门氏、耶尔森氏)- 常规判定中标准- 其它新判定系统比较金标准- 方便使用，24小时出汇报微生物综合实验第36页微生物综合实验第37页API20E23个生化结果需额外补充氧化酶结果孵育18-24小时，37oC判定可使用阅读表编码手册APILAB软件

API20E

124

124

124

124

1241

24

124

12

4124ONPGADH

LDC

ODC

CIT

H2S

UREETDAINDVP

GELGLUMANINOSORRHASACMELAMYARAOXNO2N2MOBMcCOF-OOF-F38微生物综合实验第38页利用传统生化及发酵反应作肠道杆菌判定肉眼判读原理使用20个风乾底物小杯11个传统生化及酶反应，10个发酵试验加附试剂(VP,TDA,IND...)5分钟后阅读补充试验:OX,MOB,MAC,OF,NRAPILABAPI20E39微生物综合实验第39页Aeromonas (气单胞菌属) (3)Plesiomonas (邻单胞菌属) (1)Vibrio (弧菌) (7)Pasteurella (巴斯德氏菌) (3)Chromobacter (色杆菌) (1)Chromobacterium (色杆菌属) (1)Pseudomonas (假单胞菌属) (5)Burkholderia (伯克霍尔德菌属) (2)Chryseomonas (金色单胞菌属) (1)Chryseobacterium (金色杆菌属) (2)Flavimonas (黄色单胞菌属) (1)Xanthomonas (黄单胞菌) (1)Acinetobacter (不动杆菌属) (1)Moraxella (莫拉菌属) (1)Flavobacterium (金黄杆菌) (3)Weeksella (威克斯菌属) (2)Bordetella/Alcaligenes (1) (博德特氏菌属/产硷菌属) Achromobacter (无色杆菌属) (1)Photobacterium (发光杆菌属) (1)Sphingomonas (鞘氨醇单胞菌属) (1)Shewanella (腐败希瓦氏菌属) (1)Sphingobacterium (鞘氨醇杆菌属) (1)Stenotrophomonas (寡养单胞菌属) (1)API20E数据库版本4.040微生物综合实验第40页微生物综合实验第41页API试剂盒及其配套试剂(API20E)培养盒 保持潮湿环境石腊油(容量:125ml) 覆盖在指定小孔上悬浮液(容量:5ml) 用於调菌液附加试条 加进指定生化孔内API20E试条 每个小孔载有风乾底物PSIpettes接种管 挑菌落，混匀及接种安培架微生物综合实验第42页操作步骤1(API20E)分离单个菌落挑单个可疑菌落尽可能防止使用高度选择性培养基调制菌液悬浮液(容量:5ml)微生物综合实验第43页操作步骤2(API20E)将菌液接种到小管或小管及小杯(CIT,VP和GEL)将试条放进培养盒内将5ml无菌水放进培养盒里利用石腊油覆盖指定生化孔(有划线孔)

ADH

ODC

H2S

URE把培养盖盖上微生物综合实验第44页操作步骤3(API20E)把试条放进孵育箱内，利用指定温度及时间API20E:35-37oC，18-24小时按操作说明书要求，将附加试剂加进适当小孔内api20E试剂18-24小时後微生物综合实验第45页阅读结果利用编码手册或APILABPLUS软件进出分析依听说明书上，或彩图指示，统计结果於汇报单上。微生物综合实验第46页API试剂条API试剂条由透明PVC材料制成，不一样试剂条有不一样数量反应杯，每个反应杯内包被有对应干燥生化基质，常见生化反应有以下5类：微生物综合实验第47页

API试剂盒使用由指导教师指导，每个小组提供API20E试剂条一个，每个小组选取两株菌进行判定。每个小组提供ATB判定系统相关试剂条1-2个，培训ATB细菌自动判定与药敏系统使用方法。微生物综合实验第48页第三阶段：菌株保藏---个体形态---生理生化特征时间表：各试验交叉进行，拟4月21-23号进行API试剂条及ATB试剂条判定；5月1日前结束生理生化特征测定，但结果可延后观察。微生物综合实验第49页第四阶段：分子判定----生物信息学分析

16SrDNA序列扩增：1、理论知识学习，指导老师发参考文件；2、5月5号左右活化菌株，拟5月7号早晨