生物制药人源化单克隆抗体专家讲座

人源化单克隆抗体

研究进展和应用组员：洪武平王松振王雁庆曾亚威09生物技术生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第1页

单克隆抗体在理论和实践上应用成为处理生物学和医学等许多重大问题主要伎俩。不过，上述应用单抗属于鼠源性，鼠源性单抗应用于人类临床应用结果反应出了单克隆抗体药品存在一些问题:(1)鼠源性单抗轻易轻易产生人抗鼠抗体(HAMA),在体内作为异源蛋白被去除掉，从而减弱其治疗有效性。(2)鼠源性单抗在人体内生物活性降低，不能有效地激活人体生物效应。研究背景所以，人们一直致力于人源性抗体研究。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第2页人源化治疗性单克隆抗体研究进展构建基本思绪鼠抗体人源化就是经过基因改造，使其和人体内抗体分子含有极其相同轮廓，从而逃避人免疫系统识别，防止诱导HAMA（人抗鼠抗体）反应。恪守两个标准首先，要保持抗体亲和力和特异性；其次，要降低或消除抗体免疫原性。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第3页以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原子文库。

以该技术制备抗体片段(Fab)是人源抗体，含有建库简单、抗体表示稳定等特点。迄今已经有各种抗体产生。能够预见，该技术含有良好发展和应用前景。处理方案：（1）用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；（2）用EB病毒转化人B淋巴细胞；（3）用基因工程法制备嵌合抗体等。效果不强（4）最新方法：——抗体库筛选技术和转基因鼠技术生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第4页单克隆抗体发展史第一代：鼠源性单抗药品特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。不过因为其代谢比较快，当前在放射性元素标识单克隆抗体药品中使用。第二代：人鼠嵌合性单抗进行人源化改造，使其人源化程度到达70%左右。第三代：CDR移植抗体和SDR移植抗体人源化程度到达95%左右，大大降低了毒副作用。第四代：全人源化单抗

年，世界首个药品——阿达木单抗上市。人源化及全人源单克隆抗体因为副作用小，在体内停留时间长，更有利于治疗。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第5页人源化程度生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第6页1.嵌合抗体（Chimericantibody)用人源基因代替鼠源单抗恒定区，即该单抗由鼠可变区和人恒定区组成嵌合抗体。因为嵌合抗体可变区（V）约占整个抗体30%，鼠源性抗体V区中框架区（FR)仍残留一定免疫原性，可诱导HAMA反应。灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，经过免疫短尾猿猴产生。因为其抗体可变区与人可变区无差异，不至于发生抗体反应。缺点处理方案鼠源抗体嵌合抗体生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第7页生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第8页2.CDR移植抗体（CDRgraftedantibody)真正意义上抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区（CDR）是鼠源外，其余全部是人源结构，人源化程度可到达95%以上，含有更高安全性和更低毒性。不足有时异基因CDR人源化抗体可能引发抗个体基因型反应。改良方案——进行SDR移植改良嵌合抗体人源化抗体3个CDR生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第9页3.SDR移植抗体(SDRgraftedantibody)在CDR移植抗体基础上，将异源抗体中与抗原结合亲密相关SDR等少数残基移植到人抗体对应位置上，深入降低了抗体异源性。经过这种方法，使人源化抗体潜在免疫原性降至最低。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第10页4.全人单克隆抗体（Fullyhumaneantibody)它是将体外克隆抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表示，然后用抗原筛选即可取得特异单克隆噬菌体抗体。

在HIV等病毒感染和肿瘤诊疗与治疗方面有其独特优越性。

4.1.抗体库筛选技术4.1.1.噬菌体表面展示技术鼠源抗体完全人源化抗体生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第11页基本原理和程序

噬菌体抗体库人免疫细胞基因组PCR技术扩增整套抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因噬菌体DNA中有抗体基因外壳表面有抗体分子表示克隆并以融合蛋白形式表示基因重组噬菌体重组DNA构建利用抗原-抗体特异性筛选所需抗体并进行克隆扩增取得可溶性抗体片段表示生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第12页不足1.在噬菌体展示过程中包括细菌转化、噬菌体包装、展示跨膜分泌，这就大大限制了所建库容量和分子多样性。当前，惯用噬菌体展示文库容量在109。2.不是全部序列都能在噬菌体中取得很好表示，因为有些蛋白质功效实现需要折叠、转运、膜插入和络合，造成在体内筛选时需要外加选择压力。3.噬菌体展示文库无法进行有效体外突变和重组进而限制了文库中分子遗传多样性。4.因为噬菌体展示系统依赖于细胞内基因表示，所以一些对细胞有毒性分子（如生物毒素分子)极难得到有效表示和展示。

生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第13页4.1.2.核糖体展示技术基本原理和程序

人免疫细胞基因组EDTA体外转录、翻译、偶联mRNA-核糖体-蛋白质三聚体核糖体展示蛋白文库构建基因型和表型联络利用抗原-抗体特异性筛选所需抗体复合体EDTA解离取得特异mRNART-PCRRT-PCR特异抗体DNA子文库取得特异性、高亲和力抗体表示生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第14页

传统筛选技术含有本身难以克服缺点，主要表现在构建文库和筛选时都包括细胞转染、噬菌体包装、跨膜分泌和蛋白质降解等很多方面问题，文库容量及其分子多样性在某种程度上受到很大限制，降低了文库筛选效率。核糖体展示技术因为在体外无细胞翻译体系中进行，用mRNA可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率限制。它大大提升了文库容量和筛选通量（1012-1014）而且能够增加表示蛋白质溶解度。优势生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第15页4.2.转基因小鼠经过基因敲除技术，使小鼠本身基因失活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇转基因小鼠。这种人抗体基因小鼠所携带人DNA片段含有完善功效，能够有效地进行同型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力人抗体。案例：日本麒麟企业用基因工程技术，使小鼠携带完整人14号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。但迄今尚无该技术生产制品问世。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第16页4.3.微胞杂交干细胞技术——日本学者Ishida等首先提出技术关键点：

首先将抗G418人成纤维细胞与小鼠A9细胞融合，经过筛选，得到抗G418小鼠A9细胞，再利用PCR或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出细胞用秋水仙素处理48h，然后用细胞松弛素B处理并高速离心，分离出含2号、14号、22号染色体小鼠。人源抗体在这种转基因小鼠产量还比较低。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第17页4.4.其它方法XTL生物制药企业使用一个类似于人骨髓移植方法，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该企业已用此法生产出一个全人单抗。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第18页近年来,人源化抗体和人抗体出现为临床应用带来了新希望,当前正处于临床研究各种抗体中,嵌合抗体和人源化抗体所占比例大于70%。当前人源化抗体,主要用于肿瘤、本身免疫性疾病和心血管疾病治疗以及抗移植排斥反应和抗病毒感染等方面。人源化抗体临床应用生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第19页1.在肿瘤治疗方面应用:

单抗药品抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药品治疗不良反应。如我国开发出癌症治疗药——重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体(商品名：泰欣生)。泰欣生联合放疗治疗鼻咽癌完全缓解率比单纯放疗患者提升30%以上。2.在器官移植中应用:

近年来,利用抗体药品作为实体器官移植诱导治疗逐步增加。如1986年同意进入美国市场治疗性抗体类药品抗CD3单抗即被用于肾、心脏、肝脏移植排斥逆转。3.在心血管疾病方面应用：美国FDA于1994年同意了第一个人-鼠嵌合Fab抗体上市，该抗表达已被广泛应用于各种心血管疾病治疗,主要用于预防冠状动脉成形术后再狭窄。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第20页4.在本身免疫性疾病方面应用:

现有研究表明,抗体对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、多发性硬化、硬皮病、溃疡性结肠炎等疗效很好。5.在抗病毒感染方面应用：近年来研究表明,在HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病中,人源化抗体显示了很好应用前景。如：商品名为SynagisTM抗呼吸道病毒感染抗体在美国已经上市,为人源化基因工程抗体。生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第21页生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第22页应用单克隆抗体后患者症状改进率生物制药人源化单克隆抗体专家讲座第23页总结到当前为止，最少有35个完全人类单抗已经进入临床治疗试验阶段。这些单抗靶抗原都是临床癌症、本身免疫疾病或炎症疾病和传染病中主要抗原。比如EGFR、CTLA-4和CD4等。在治疗一些异种移植、骨质疏松症等疾病已经有显著效果。

抗体人源化以及完全人源化