烟草基因组中NBS类抗基因的分析

综述烟草是一个主要经济作物，烟草行业首先能够为国家增加税收，同时对发展国民经济和满足人民生活需要，都起了重大作用。烟草作为模式植物，对于植物科学发展来说，不论是在基础研究还是在应用方面都起了很大作用，尤其是在遗传、育种、生理、生化以及采收后代谢方面。烟草也是研究植物病原互作最好模式作物之一。抗性基因在植物与病原互作过程中，起到非常主要作用。所以反抗性基因研究，不论对植物本身，还是对指导育种都有非常主要意义。在烟草基因组测序背景下，我们对烟草抗性基因进行了一些基础性研究。烟草基因组中NBS类抗基因的分析第1页研究过程烟草基因组分析

(基于TGI基因组序列)

NBS类抗性基因生物信息学分析

烟草NBS类抗性基因

遗传多态性分析

NBS类抗性与抗性基因连锁基因家族分析SSR分子标识开发

烟草基因组中NBS类抗基因的分析第2页

关于TGI（TobaccoGenomeInitiative

/）

数据类型条数/平均长度累计长度（Mb）占基因组百分比经甲基化筛选克隆序列1,082,523(5files)682.2bp738.516.4％未经筛选克隆序列16885+25023=41908746.2+682.3bp12.6+17.1=29.70.7%BAC克隆末端序列1628360.7bp0.587BAC序列

140,156(93BACs)726.9bp101.92.3％累计1,266,215

870.7

19.3％烟草基因组中NBS类抗基因的分析第3页

拼接去冗余后信息数据类型序列条数/平均长度数量（Mb）占基因组百分比覆盖功效基因（百分比）&基因密度（个/Mb）经甲基化筛选克隆序列465433984.9bp<458.4Mb<10.2％2387（18.1％）（包含BAC序列）5.10未经筛选克隆序列10777+13912927.8+926.1bp10.0+12.9=22.9Mb<0.5%200.87BAC克隆末端序列647432.1bp0.28Mb1BAC序列（5X覆盖）3,285(92BACs)3047.2bp35.7contigsperBACs;108.7kbperBAC10.0Mb0.2％//累计494054<491.2Mb<10.9%<2408(<18.2%)烟草基因组中NBS类抗基因的分析第4页全部数据起源基因组序列：TGIEST序列：TGIGenebankESTobacco(EuropeanSequencingofTobaccoProject/)TAB(TranscriptomeAnalysisofBY-2，

http://mrg.psc.riken.go.jp/strc/)

烟草基因组中NBS类抗基因的分析第5页RGA（

Reistancegeneanalogue）背景介绍IIIIIIIVVPKNBSLRRLZ/CCTIRTMPKPtoMi/PrfXa21Cf4/Cf9NNBSLRRLRRLRRTMRepresentativegene烟草基因组中NBS类抗基因的分析第6页

分析流程已知NBS抗性基因同源序列搜索清理拼接基因预测蛋白预测寻找结构域系统发育树烟草基因组中NBS类抗基因的分析第7页

已知NBS类抗性基因ClassmotifRgenePlantPathigenAvrgeneAccessionLZ-NBS-LRRCCNB-ARCLRR5RPS2ArabidopsisthalianaPseudomonassyringaepv.tomato&maculicolaavrRpt2Q42484，P49597LZ-NBS-LRRTIRNB-ARCLRR9RPP1ArabidopsisthalianaPeranosporaparasiticaAAC72979，LZ-NBS-LRRCCNB-ARCLRR2RPP8ArabidopsisthalianaPeranosporaparasiticaAAC83165，LZ-NBS-LRRNB-ARCRPP13ArabidopsisthalianaPeranosporaparasiticaQ9M667，T51185，AAF42832，LZ-NBS-LRRNB-ARCLRR5RPM1ArabidopsisthalianaPseudomonassyringaepv.maculitolaavrB,avrRpmlCAA61131TIR-NBS-LRRTIRNB-ARCLRR7RPS4ArabidopsisthalianaPseudomonassyringaeavrRps4CAB53785，TIR-NBS-LRRTIRNB-ARCLRR9RPP5ArabidopsisthalianaPeranosporaparasiticaavrRp5AAF08790LZ-NBS-LRRCCNB-ARCLRR4RPS5ArabidopsisthalianaPseudomonassyringae,PeranosporaparasiticaavrRphBQ8L3R3，NBS-LRRNB-ARCBs2CapsicumannuumXanthomonascampestrispv.resicatoriaavrBs2CAC32382,CC-NBS-LRRMla1HordeumvulgareErysiphegraminisf.sp.hordeiAAG37356TIR-NBS-LRRTIRNB-ARCL6LinumusitatissimumMelampsoraliniAL6Q40253,Q40254烟草基因组中NBS类抗基因的分析第8页TIR-NBS-LRRTIRNB-ARCLRR5MLinumusitatissimumMelampsoraliniAMAAB47618,LZ-NBS-LRRNB-ARCLRR3Rx2LycopersiconesculentumTomatovirusXPVXCAB56299,LZ-NBS-LRRNB-ARCPrfLycopersiconesculentumPseudomanassyringaepv.tomatoavrPtoAAC49408LZ-NBS-LRRNB-ARCLRR2MiLycopersiconesculentumMeloidogynejavanicaunknownAAC67238,AAC67237,AAC32252NBS-LRRCCNB-ARCLRR11I2C-1LycopersiconesculentumFusariumoxysporumunknownAAB63274NBS-LRRNB-ARCSw-5LycopersiconesculentumTomatospottedsiltvirus(TSWV)AAG31013TIR-NBS-LRRTIRNB-ARCLRR8NNicotianatabacumTobaccoMasaicVirusTMVQ40392NBS-LRRCCNB-ARCLRR10XalOryzasativaXanthomonasoryzaepv.oryzaeavrXooO48647NBS-LRRNB-ARC2LRR2PibOryzasativaMagnaporthegriseaBAA76281,NBS-LRRNBS-LRRPi-taOryzasativaMagnaporthegriseaAAK00132NBS-LRRCCNB-ARCCre3TriticumaestivumHeteroderaavenaeAAC05834LZ-NBS-LRRRPP4ArabidopsisthalianaAAM18462LZ-NBS-LRRRPM1ArabidopsisthalianaPseudomonassyringaeQ39214CC-NBS-LRRI2LycopersiconesculentumFusariumoxysporumf.sp.lycopersicirace2AAD27815NBS-LRRI2C-2LycopersiconesculentumFusariumoxysporumunknownAAB63275I2C-3LycopersiconesculentumFusariumoxysporumunknownAAB63276RVignamungoAAQ75745烟草基因组中NBS类抗基因的分析第9页DataSourceSpeciesCultivar/TypeSeq.No.(Mb)IntactPartialClusterReadsClusterReadsGenomeTGIDNAN.tabacumHicksbroadleaf1,441,358(807.4)30234914549ESTTGIN.tabacumHicksbroadleaf14,475(7.6)0034ESTobaccoN.tabacumFlue-cured(K326),Burley(Burley21andTN86)46,546(30.4)0022TABN.tabacumBright-YellowNo.2(BY-2cells)18,851(9.3)0022

烟草基因组中判定出NBS类基因结果统计烟草基因组中NBS类抗基因的分析第10页

烟草基因组中30个NBS类基因分类StructureNumberAverageCDSlength(bp)No.withESThitsCC-NBS-LRR112,7798TIR-NBS-LRR12,6041TIR-NBS21,5361NBS-LRR72,5546NBS91,6121Total302,28816烟草基因组中NBS类抗基因的分析第11页烟草基因组中NBS类抗基因的分析第12页烟草和其它植物间NBS类基因系统发育关系蓝色，绿色，紫色和黄色分别代表烟草，拟南芥，番茄和杨树烟草基因组中NBS类抗基因的分析第13页

试验部分

PCR扩增产物直接测序克隆测序遗传多态性分析基因家族系统进化分析30对引物24个材料烟草基因组中NBS类抗基因的分析第14页本研究使用烟草材料品种名称（野生为物种名）杂交组合类型黑胫病青枯病根结线虫病CMV烟蚜样品类型原产地长脖黄烤烟感病感病地方品种河南小黄金1025小黄金系选烤烟感病感病中感高感抗虫选育山东SpeightG-28(Oxford1-181×Coker139)F4×NC95烤烟中抗感病抗病抗虫国外美国红花大金元大金元系选烤烟中感感病中抗中抗高感选育云南云烟87云烟2号×K326烤烟中感中抗中抗选育云南大白筋599大白筋系选烤烟中感中感高感选育山东Coker176(Coker258×(61-10×Coker319)×Coker258×(Coker139×59-84))×(Coker258×(61-10×Coker319)×Coker258×(Coker139×59-84))DWARF烤烟中抗中抗中抗中感高感国外美国N.repanda野生感病感病抗病国外墨西哥Coker371-Gold烤烟抗病国外美国净叶黄长脖黄系选烤烟中感感病中感抗病抗虫选育河南K326McNair225×(McNair30×NC95)烤烟中感感病中抗中感中抗国外美国T.I.245烤烟抗病国外美国烟草基因组中NBS类抗基因的分析第15页Ambalema晒烟中感感病中抗感病高感国外美国Beinhart1000-1雪茄抗病感病中感国外美国TI晒烟中抗感病感病感病高感国外国外Florida301雪茄抗病感病感病国外美国C151Ti245×75-81烤烟耐病选育广东N.plumbaginifolia野生抗病感病中感国外阿根廷Coker86烤烟感病中抗抗病中抗感虫国外美国NC826129×Coker319烤烟中感中感感病中感感虫国外美国K346烤烟抗病抗病抗病国外美国N.undulata野生国外秘鲁N.glutinosa野生感病中抗中感国外秘鲁N.sylvestris野生感病感病国外阿根廷北部Hicks(BroadLeaf)烤烟感病感病中感感虫国外美国香料国外土耳其KomotiniBasma香料国外土耳其samsun白肋感病感病感病国外阿尔巴尼亚burley21白肋感病中感高感国外德国TN86白肋感病国外美国注：抗性等信息来自中国作物种质信息网（）烟草基因组中NBS类抗基因的分析第16页

引物设计位点植物抗性基因结构和本研究引物设计位点。图中标出了NBS功效域三个主要基序和C-和N-端通常含有功效域，箭头为本研究引物设计位点烟草基因组中NBS类抗基因的分析第17页本研究设计30对烟草RGA引物序号引物名称序列(5'to3')碱基数1133_nbs_FTCTTCTTACTTCCCAATACCGTAG24133_nbs_RCCTTCATCACTTCCTCTTCATCC232141_nbs_FGATCGTTGACCAAATTTCCAAG22141_nbs_RCAACTCTTGAGAACTTGCATGATG243147_nbs_FGCAATCCACAACTGAATGACTTG23147_nbs_RTGGAAAAGCAAATTGGTAGGC214148_nbs_FGGCAAATGCTTATAGCTATGCTC23148_nbs_RCAGAGGTACCAAAGATCCAGC215155_nbs_FTGGTAAACAAGAAACTAGAGGACC24155_nbs_RGACCATTAGCAATCCACAACTG226162_nbs_FGACATGTTGAAGATCACCCGG21162_nbs_RGCCTTTGTGACATGGTTTGAC217173_nbs_FATCAAGCACAGTCCGAACAAC21173_nbs_RCTCCTGAGCATTGTTGATAAGC228178_nbs_FCGATTCAACTATATCCATGCAACC24178_nbs_RCCCATTGCTTATCCTTCTAGTTTC249182_nbs_FAAGGCGCATGCAATATCGAGG21182_nbs_RTCATCCCACTGTGTTATGTCTTGG2410191_nbs_FCTGAAACCAATTATAGACATGCCC24191_nbs_RCACTGTGGTACAAAGTTCATTGG2311209_nbs_FGGTGATCCGATAAATGGTCATAAC24209_nbs_RTTCTTGTCAGAGATCATGGTCTC2312224_nbs_FAGTGGTCGAGGTTGACTTAGTATC24224_nbs_RGGCTTAAGATGACATGGTAAATCC2413226_nbs_FGGCAATTCAAAACAAGCTCAAG22226_nbs_RTGCATTGGACATTAACCTCTG2114228_nbs_FGGAGAAGTTGGAAGGCACCAC21228_nbs_RCGGGAAGATCATTGTAGCTCAAC2315265_nbs_FCATGAAGATTCAACACAAAGGC22265_nbs_RCCCAAGTACATGCAAACATTG2116267_nbs_FCAGCAAATTGGTTGTCTTGGC21267_nbs_RAACATCAACGCTGGTAATATGC2217270_nbs_FCTCCTAAGCATTTATCTGGATGAC24烟草基因组中NBS类抗基因的分析第18页18271_nbs_FGTCCTCTCTGGTGCCTTGAG20271_nbs_RCACACGGTCCTCTAAAAATGC2119329_nbs_FGCTGAGCTGCTTAACAATTTCTTC24329_nbs_RCATCGACAGGATTTCTGGTTAC2220334_nbs_FAAGGAGAAGTTGGAAGGCACC21334_nbs_RGTAGCTCAACATTAACGCCGG2121345_nbs_FTCGAGGAACAGATTCTGTACATC23345_nbs_RCAATCCAATTTTCAGGTGTGAGTC2422358_nbs_FCTTCTTGTTGTGAACTCTCCCAG23358_nbs_RGGCTTGAGGTGATTAGATAGATGG2423359_nbs_FGAATCCAATCACAGACATGGTC22359_nbs_RCACTCTGGTACAAAGTTCTTTGG2324374_nbs_FCTCTATCATAGCCTTTGCGTCAC23374_nbs_RGAAGAAAACACCTGCAGTTGAC2225383_nbs_FGCAATGCAATGAACACTGACATAG24383_nbs_RTCCACAACCATGTCAACTTTG2126390_nbs_FCAGCAACAACTTATTTACCTCCC23390_nbs_RCCACCCAAATTCTAATCAACG2127391_nbs_FTCAACAACTGACATGGACGTAG22391_nbs_RTACCTTCATGCTCTGCTCTCC2128410_nbs_FCTCTTTTGTATCGATTAGTCCCTC24410_nbs_RGGATCTGCCTATGTGTTAAACTTC2429414_nbs_FGCAATCTTCTCTCCCTTTCCC21414_nbs_RTGGGCTCTAATCCATCATAACTG2330TGAACAAGTTGGGCCATGTA2030RGGTTCTCTTCGTTTCCCCTTA21烟草基因组中NBS类抗基因的分析第19页基因栽培品种数野生种数NBS133212NBS14821NBS2709NBS16283NBS26581NBS39062NBS3916NBS305NBS15542NBS1913NBS41432NBS20942NBS22832NBS14741NBS35811NBS22421NBS4102NBS3832NBS1412累计11419PCR产物直接测序判定烟草RGA基因

烟草基因组中NBS类抗基因的分析第20页得到以下遗传多态性分析结论：

1、栽培与野生烟草之间存在显著遗传多态性烟草基因组中NBS类抗基因的分析第21页烟草基因组中NBS类抗基因的分析第22页基因位点栽培品种数量长度(bp)个数密度（个数/Kb）SNPINDELSNPINDELNB75）49.311.0（102.7）

NBS1628879523（6）59.23.4（6.8）

NBS390659723038.50（0）

NBS1554824942（7）114.12.4（8.5）

平均值9.8757.551.33.3（22）65.34.2（29.5）栽培烟草与其野生祖先种（N.sylvestris）之间分子多态性注：括号中为累计长度（bp）烟草基因组中NBS类抗基因的分析第23页

2、栽培烟草RGA基因遗传多态性表现出极端同质性烟草基因组中NBS类抗基因的分析第24页烟草基因组中NBS类抗基因的分析第25页基因家族基因组特异克隆克隆测序总数NBS226Coker1761415HHDJY1621NBS271Shamxun1115HHDJY1833NBS173HHDJY1425NBS374HHDJY1323NBS329HHDJY1515NBS345HHDJY1515NBS359HHDJY1315NBS334HHDJY1315NBS267HHDJY1515NBS182HHDJY1515NBS178HHDJY测序中测序中累计172222克隆测序判定烟草RGA基因家族HHDJY:红花大金元烟草基因组中NBS类抗基因的分析第26页

烟草RGA基因亚家族遗传分化与进化

1遗传分化分析

对11个RGA家族内组员遗传分化程度进行了分析：对这些

RGA基因家族组员分别进行建系统进化树，依据树型，有些树分化程度显著较大（如NBS334），表明这些亚家族内部分化显著。烟草基因组中NBS类抗基因的分析第27页ABCDE

FGH基于RGA核苷酸序列和临接法（NJ）构建烟草RGA基因4个亚家族系统进化树。A:NBS226;B:NBS173;C:NBS271;D:NBS374;E:Nbs359;F:NBS182;G:NBS334;H:NBS267烟草基因组中NBS类抗基因的分析第28页

2进化分析深入对RGA亚家族选择进化进行分析。RGA基因进化历程可能是处于一个中性随机突变情况（M1a和M7模型）或受到正向或负向（又称净化）选择（M2a和M8模型）。依据Yang等（）方法(Yangetal.,)，我们能够预计烟草RGA基因亚家族组员序列组成符合哪个进化模式。结果表明

在测验8个RGA基因中，大多受到强烈净化选择，同时部分基因在其个别位点上受到显著正向选择。烟草基因组中NBS类抗基因的分析第29页

烟草RGA基因亚家族进化选择测验（似然比）结果考虑到测序等误差，所选取每个RGA亚家族组员间序列差异度≥1%(Couchetal.,)烟草基因组中NBS类抗基因的分析第30页

烟草基因组RGA基因系统进化关系

经过PCR产物直接测序和克隆测序，共取得426条特异RGA基因序列，包含来自栽培烟草11个RGA家族293条基因序列和19条野生烟草基因序列。经注释，除了部分因为移码、终止子等造成假基因，其中绝大多数序列能够取得完整NBS蛋白质序列。为了确定这些基因序列系统进化关系和亚家族归属，我们对取得全部序列和已知烟草和其它主要类型抗性基因进行了系统进化分析。从系统进化树能够看出，我们判定烟草RGA几乎覆盖了所以类型已知抗性类型，包含TIR-NBS类和大量非TIR-NBS类基因。非TIR-NBS类基因中，烟草中一个烟草亚家族（I2，红色部分）已进行一定数量测序调查(Couchetal.,)，我们取得数据也一样包含了这类RGA基因序列。同时，与已知抗性基因有较大差异一批烟草RGA被发觉，这部分RGA基因表现出烟草RGA特异性，其中部分可能是烟草特有RGA。烟草基因组中NBS类抗基因的分析第31页基于RGA蛋白质序列和临接法（NJ）构建烟草RGA基因系统进化树图中包含本研究取得烟草NBS类抗性基因（黑色）、GeneBank数据库中已经有烟草RGA基因序列（红色）和当前已克隆抗性基因（其它颜色）。

烟草基因组中NBS类抗基因的分析第32页烟草RGA类抗性基因SSR分子标识开发前期对烟草RGA基因进行了基因组分析，发觉了一大批烟草RGA基因，遗传多态性分析结果表明，烟草RGA基因存在高度遗传同质化，这给发觉与抗性相关RGA增加了难度。为了探索取得与抗性相关RGA或对应标识高效路径，本研究利用烟草基因组序列开发了与RGA紧密连锁SSR标识。烟草基因组中NBS类抗基因的分析第33页分子标识开发流程在基因组中查找含有RGA区段序列在其上下游寻找SSR序列设计引物23个烟草材料中进行PCR扩增烟草基因组中NBS类抗基因的分析第34页用于开发烟草SSR标识23个栽培烟草品种及其野生种基本信息序号品种名称类型抗性原产地黑青根CMV蚜1小黄金1025烤烟山东2红花大金元烤烟---++++---云南3K326烤烟---++--++美国4HicksBroadLeaf烤烟-----美国5301雪茄+--美国6（沙姆逊）白肋---阿尔巴尼亚7burley21（白肋

21）白肋------德国8TN86白肋-美国9土耳其巴斯玛香料土耳其10N.undulata野生秘鲁11N.glutinosa野生-++--秘鲁12N.sylvestris野生--阿根廷13N.repanda野生--+墨西哥14N.plumbaginifolia野生+---阿根廷15Ambalema晒烟---++----美国16TI晒烟++-–----国外17Beinhart1000-1雪茄+---美国18长脖黄烤烟-------+河南19斯佩特基-28烤烟++------美国20云烟87烤烟--++++云南21Coker176烤烟++++++-----美国22C151烤烟O广东23NC82烤烟--------美国注：黑：黑茎病；青：青枯病；根：根结线虫病；CMV:烟草花叶病毒病；蚜：烟蚜；

-：感病；--：中感；---：高感。+：抗病；++：中抗。O：耐病。烟草基因组中NBS类抗基因的分析第35页开发烟草中与RGA相关SSR标识设计引物引物名称正向引物（FWD_PRIMER）反向引物（REV_PRIMER）重复基元目标片段（bp）退火温度（℃）TSN1001GGCCTGCATGAATAAAAGAAAGAACCTCCCATGAAGATTGTATGAACAGA15855TSN1002CAGAGGTTAAACCAACCCAAAATCACCCATGGAGGAATGGCTAGTAG16055TSN1003ATTGTTTTCACCCATGGAGGATTAGTCTGACGATCACTGAAAACACGTC13655TSN1004GTCCAATTAGAGGGGAGGGAACTACCTCCAGTGTCAACATCATCTACGGAA15355TSN1005CTAGACGGCACGACACTGTGTTAACAAACTCGATTCAGAACATGCAACTAT14855TSN1006CTGGCTTACCTCCATGAAGATTGTGCCTGCATGAATAAAGCAAGAAATCT13455TSN1007TCTTCCAAAAAGAGTACGCAATCACAGATGTTCAAACAAATACAGATGTCGAAT15355TSN1008GTGCGTAAGAAGTTGAGCTTACCCAGTTTTCTGGCATATGAGGAGGTGTA13655TSN1009ATCTCTCCTGTCAAGTGTGGGAAATCTTCGAGACCTGCACTTAGAAGGAG14555TSN1010CGGGTACATTTTCTTGATTCAACTGCAACAAAATAGATAACTTACCACGTCAT23055TSN1011TTAAAATGTTGTTTCCTCATGATTTTTTTTTAAACACAAGACAATTGTACCCAAG14755TSN1012CAGCACAACGAAGATGAAGAAAATTTTGGGGAGTTTTATTTTATAAGGGATA15955TSN1013TTAACTGCTCGTCTCGTCAGTTTGTTCCTTATGCCACGTCACCTCTATTC14855TSN1014CATCACTATTTATCAAGTTAAACCGGAACTTGTGTCCAAGTGGTGTAGTTTAGTTAT15855TSN1015AGTAGGTTTGTGTACAACTGTCAATAGCATCGAATACCGAAGTACCAAATCATA15955TSN1016GCATCCTCTCAAGCCCTTTTTAATGGTTTGGTTTTGTCCATGAGTAGGTC13055TSN1017TTTCAAATAGCAGTAGCATTTCATCATGTCCAAACAACATTCATTTTATTCATCT14355TSN1018CCCCAAACCCCTAAAACCCTGGTTTCGGGTTTCGGGTTACAAACCCG20155TSN1019AACACTGAGTCCATGTCATCATCATTCCCCTATCATTCAAGACTTCGTTCT15155TSN1020ACTAGTTGTGTGAAGGGGATGTGATTCTGAAGGTCAAGGGCTAGATTGAGA12255TSN1021AGGTCTAGCTCAGAATGCACAATGAATCATATACACACATGGCACAGGAAT13155TSN1022TAAGAAAGAAGACAACGACGACGACGGAGTAGGGGCAAGATCTATGTAACA11555TSN1023CTTTTGGGCTCTCTTCTCTCATTGCACATAAGCTCATTGGATTTGCAGTTC13755TSN1024GTTTTTGGTGAGGTGCTTTCAGATCCAATTCCAACATCATCACATAATAAAGT14755TSN1025CATGGACCAAGTAAATCACTGTCGTCAACAATGCTTTTCGATTCATTCCT15955TSN1026CCAATGGACTTCAACATAAAGCAAGTGAAAGTCCCATTTGGATCTTCTTGA10955TSN1027TAAGGTCAATGGTTAAAGCGTCGTTAAACCCAAATCTCTCTGACCCCTGA8655TSN1028AGTGCTGATAGAAGGAATGGCTTGGCCCAGTTCTGATTACCAGAGAGAGTAT13655TSN1029ATAAATGCTCTTGTCGTTTATTTCTTTTTTCCACTCTCTTCTTTACACCACAAT15555TSN1030ATGGCCATTTCTTTGGTTTTGAACTACTCTACCCAA