细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法(法)专家讲座

试验四细菌涂片及简单染色法和

革兰氏染色法（经典法）细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第1页【目标要求】学习并了解简单染色法原理，并掌握其操作方法。掌握微生物涂片、染色基本技术和无菌操作技术。了解革兰氏染色法原理，并掌握其操作方法。了解革兰氏染色法在细菌分类判定中主要性。学习并掌握微生物涂片、染色基本技术和无菌操作技术。巩固显微镜(油镜)使用方法。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第2页【基本原理】一、细菌涂片及简单染色法基本原理

细菌涂片和染色是微生物学试验中一项基本技术。所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色一个方法。此法操作简便，可用以观察微生物形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便染色法。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第3页【基本原理】

用于生物染色染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。染色前必须先固定细菌，其目标有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料亲和力。惯用有加热和化学固定两种方法。固定时应尽可能维持细胞原有形态，预防细胞膨胀或收缩。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第4页【基本原理】二、革兰氏染色法（经典法）基本原理

革兰氏染色反应是细菌分类和判定主要性状

革兰氏染色法（Gramstain）不但能观察到细菌形态而且还可将全部细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第5页【试验用具】1、菌种金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌（注：大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球状细菌，经过革兰氏染色，二者着上不一样颜色，在显微镜下便于区分。同时，因为二者含有不一样个体形态，在对它们混合涂片进行革兰氏染色后，依据菌体颜色和形态差异，能够判断染色是否成功。）2、仪器显微镜(25台)；3、材料载玻片（每组4个），酒精灯（每组1个），接种环（每组1个），擦镜纸，二甲苯、香柏油，吸水纸，染色缸等； 细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第6页【试验用具】4、染料草酸铵结晶紫（CrystalViolet,CV）、沙黄、吕氏碱性美蓝染液。 1）草酸铵结晶紫染液配制：A液： 结晶紫 2g 95％乙醇20mlB液： 草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml需在用前48h将A液、B液混合，装入棕色试剂瓶内备用。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第7页【试验用具】2）沙黄染液配制：A.贮存液： 沙黄 2.5g

95％乙醇 100mlB.应用液： A液 10ml蒸馏水 90m细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第8页【试验用具】3）吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液A液：美蓝(methyleneblue)0.6g95%酒精30mlB液：KOH0.01g蒸馏水100ml分别配制A液和B液，配好后混合即可。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第9页【方法步骤】一、细菌涂片及简单染色法涂片固定染色水洗干燥镜检清理干燥细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第10页【方法步骤】图1涂片、干燥和热固定细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第11页【方法步骤】二、革兰氏染色法（经典法）

1、涂片在洁净无油腻玻片滴两小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后接种环挑取少许菌体与水滴充分混匀，涂成极薄菌膜，两种细菌要混合地方。

2、固定将制成涂片自然干燥，冷却后固定，固定时经过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第12页【方法步骤】3、染色⑴初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。⑵媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。⑶脱色滴加95%乙醇2-3次，脱色20-25s马上水洗，以终止脱色。（此步至关主要）。⑷复染滴加0.5%沙黄，染色2-3min，水洗。最终用吸水纸轻轻吸干。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第13页【方法步骤】4、镜检干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。右图为革兰氏染色法显示炭疽和金黄色葡萄球菌细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第14页【方法步骤】细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第15页【注意事项】

难以严格要求。普通可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌混合涂片，以资对照。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。选取对数生长久细菌为宜。若菌龄太老，因为菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第16页【试验汇报】1．结果1）绘出油镜下观察菌体图像

革兰氏染色效果金黄色葡萄球菌大肠杆菌混合菌细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第17页【注意事项】玻片要洁净无油，不然菌液涂不开。挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。制片要完全干燥后才能用油镜观察。革兰氏染色成败关键是脱色时间。如脱色过分，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动快慢及乙醇用量多少等原因影响，细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第18页2）填表

表1细菌形态描述【试验汇报】细菌的涂片和简单染色法和革兰氏染色法（法）专家讲座第19页【试验汇报】2．