抗体制药医学知识讲座

抗体制药医学知识讲座抗体制药医学知识讲座第1页1、抗体（Antibody，Ab）：指能与对应抗原特异性结合含有免疫功效球蛋白。抗体产生原因：机体免疫系统因病原菌、病毒感染，受抗原物质刺激后产生B淋巴细胞，被活化B淋巴细胞经增殖、分化产生浆细胞，浆细胞合成和分泌抗体。抗体制药医学知识讲座第2页2、免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）：含有抗体活性及化学结构与抗体相同球蛋白统称为免疫球蛋白。全部抗体均是Ig，但并非全部Ig都是抗体。Ig是化学结构概念，抗体是生物学功效概念。抗体制药医学知识讲座第3页3、多克隆抗体：针对各种抗原决定簇抗体。因为病原菌含有各种抗原决定簇抗原物质，由此刺激而产生抗体制剂是各种抗体混合物（其产量低，难以满足临床需要）。抗体制药医学知识讲座第4页4、单克隆抗体（MonoclonalAntibody，McAb）：采取B淋巴细胞杂交瘤技术，由纯一单克隆细胞系产生，针对一个抗原决定簇，结构和特异性完全相同高纯度抗体称单克隆抗体。特点：

a、含有高度特异性，均一性。

b、起源稳定，可大量生产，为抗体制备和应用提供了全新伎俩。抗体制药医学知识讲座第5页二、临床实践中作用1、用于疾病诊疗

a、利用单克隆抗体检测与一些疾病相关抗原，辅助临床诊疗。

b、用放射性标识单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊疗。抗体制药医学知识讲座第6页2、McAb制剂用于疾病治疗a、针对分化抗原CD3单克隆抗体对器官移植排斥反应有显著抑制效果。b、以McAb作为载体导向药品可对肿瘤进行定向治疗。多年来经过对McAb改造，消除其鼠源性（免疫原性）并降低其分子量，只保留其同抗原特异性结合活性，再用其制备导向药品用于肿瘤治疗，进而提升了免疫导向疗法效果，使该领域得以快速发展，当前成为抗体应用研究热点。抗体制药医学知识讲座第7页第二节单克隆抗体制备单克隆抗体是将能产生抗体B淋巴细胞与含有没有限增殖能力骨髓细胞进行原生质体融合，经过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一单克隆细胞系而产生。抗体制药医学知识讲座第8页一、McAb制备普通程序

B淋巴细胞×骨髓瘤细胞↓融合杂交瘤细胞↓有限稀释↓克隆化纯一单克隆细胞系↓

McAb抗体制药医学知识讲座第9页

抗原矿物油↓↓注射活鼠注射BalB/c小鼠刺激产生免疫反应诱发产生骨髓瘤细胞↓↓制备取鼠脾脏→B淋巴细胞×骨髓瘤细胞(HGPR缺点)↓↓融合（PEG）制取B淋巴细胞分装多孔板选择性培（HAT）↓↓亲株死亡

B淋巴细胞培养杂交瘤细胞生长繁殖↓↓有限稀释、克隆化制取多克隆抗体分离出单克隆细胞系→McAb抗体制药医学知识讲座第10页二、McAb制备基础技术（一）抗原制备制备针对特定抗原单克隆抗体，首先要制备用于免疫适当抗原。1、化学合成法制备高纯度单一抗原在已知抗原化学组成和结构情况下进行。2、由病原菌、病毒或肿瘤细胞制备只能得到个别纯化，甚至是极不纯抗原混合物。抗体制药医学知识讲座第11页3、用整个细胞或病毒为免疫原刺激动物细胞产生免疫反应动物产生免疫反应后取其B淋巴细胞，B淋巴细胞融合杂交后，再经筛选、克隆化，判别筛选出纯一单克隆杂交瘤细胞系。抗体制药医学知识讲座第12页（二）免疫动物品系选择①多采取与骨髓瘤细胞供体相同品系动物做为免疫动物。因种系距离越远，产生杂交瘤越不稳定。常采取BalB/C小鼠和Lou大鼠。②应考虑所选动物对所用抗原能否产生良好免疫应答，若不能，应改用其它品系小鼠或大鼠。抗体制药医学知识讲座第13页（三）动物免疫1、体内免疫法适合用于抗原量多，免疫原性强情况，常见8~12周龄雌性鼠。抗体制药医学知识讲座第14页（1）颗粒性抗原（细胞抗原）免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔刺激动物免疫。①首次免疫，腹腔注射107个细胞。②3周后，追加免疫1~2次，腹腔注射1~5×106个在缓冲盐溶液中洗过细胞。③融合前4~5天，静脉注射1~5×106个细胞。抗体制药医学知识讲座第15页（2）可溶性抗原①按每只小鼠10~100µg抗原与福氏完全佐剂等量混合皮下注射。②3~4周后，100µg抗原在福氏完全佐剂中追加一次。③采集脾细胞前3天由静脉注射最终一次100µg抗原。因免疫后第3天B淋巴细胞增殖率最高，是处于快速分裂期细胞，有利于融合后增殖。抗体制药医学知识讲座第16页福氏完全佐剂是由矿物油、乳化剂和杀死分枝杆菌组成油包水型乳化佐剂，对于刺激细胞免疫和一些试验性免疫尤其有效。为促进B淋巴细胞转化，提升脾细胞分泌抗体能力，可在注射抗原同时加入细菌脂多糖。抗体制药医学知识讲座第17页2、体外免疫（1）特点

a、所用抗原量少（只需几µg），免疫期短，仅4~5天，干扰原因少。

b、融合后产生杂交瘤细胞不够稳定。适合用于不能采取体内免疫法情况，如制备人源性McAb；或者抗原免疫原性极弱且能引发免疫抑制时使用。抗体制药医学知识讲座第18页（2）基础方法①采取4~8周龄BaLB/C小鼠脾脏制成单细胞悬液。②加入抗原使其浓度到达0.5~5µg/ml。③在5%CO2，37℃下培养4~5天。④分离脾细胞，进行细胞融合。抗体制药医学知识讲座第19页3、其它免疫方法多年来，其它免疫方法研究较多，有脾内免疫、腹贮植入、淋巴结注射、足垫注射等方法。其目标主要是降低抗原用量和注射次数，缩短免疫周期。抗体制药医学知识讲座第20页（四）骨髓瘤细胞起源和特征1、起源（1）骨髓瘤细胞起源应同免疫动物种属一致，普通不选择产生本身免疫球蛋白细胞系。（2）鼠类骨髓瘤细胞系主要来自于BalB/C小鼠，少数来自于Lou大鼠。这些细胞系能够在D-15或其它培养基中保留，在用于融合前应保持其活力较高，当前这类细胞系有商品供给。抗体制药医学知识讲座第21页常见鼠类骨髓瘤细胞系有NS-1、X45、X63、P3.653和SP2/O等。其最适培养细胞密度为2~5×105细胞/ml，细胞密度过高易引发细胞死亡。可用培养基内酚红指示剂监测，开始生长时呈橙色，因为细胞生长，PH降低，当变为纯黄色时需补加新鲜培养基降低细胞密度，正常培养基颜色维持在黄橙色之间。抗体制药医学知识讲座第22页2、制取骨髓瘤细胞制取：用矿物油注射入小鼠腹腔内，诱发产生腹水癌型浆细胞。再由腹腔抽取腹水癌细胞，从中分离取得。抗体制药医学知识讲座第23页3、骨髓瘤细胞系特征①不能产生本身免疫球蛋白为防止杂交瘤细胞分泌抗体不纯，骨髓瘤细胞不含有产生抗体能力。②应为HGPRT缺点细胞系其细胞内嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成补救路径必须丧失。即磷酸核糖转移酶或嘧啶核苷酸激酶活力丧失，即HGPRT阴性细胞。③融合率高，轻易培养，所产生杂交瘤细胞分泌抗体能力强且长久稳定。如：SP2/O和P3.653细胞系。抗体制药医学知识讲座第24页（五）细胞融合1、基础方法：取适量B淋巴细胞（1×108/ml）与骨髓瘤细胞（2~3×107/ml）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间在2min内。然后用HAT培养液将PEG融合液迟缓稀释。抗体制药医学知识讲座第25页2、促进融合条件①分子量在400~6000，浓度在10~60%之间PEG溶液都能使细胞发生融合。当前常见分子量4000，浓度为40~50%PEG溶液为最正确。②在PEG溶液中加入二甲基亚砜（DMSO），以提升细胞接触紧密性，提升融合率。但PEG和DMSO都对细胞有毒性，必须严格控制它们与细胞接触时间，应尽快用新配制培养液来稀释助融剂并洗涤细胞。③经过低速离心使细胞接触更为紧密来提升融合率。抗体制药医学知识讲座第26页（六）选择性培养细胞融合后，可产生各种融合细胞，B-B、B-瘤、瘤-瘤融合细胞，还有许多未融合亲株细胞，它们均比B-瘤融合杂交瘤细胞有更强增殖能力，很易将其淘汰。所以，融合后必须马上移入选择性培养基中培养。抗体制药医学知识讲座第27页（1）选择性培养原理选择性培养基为HAT培养基，它是用次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制。其中氨基喋呤（A）能阻断DNA合成主要路径。骨髓瘤细胞因是HGPRT缺失型，无DNA合成赔偿路径，所以瘤细胞和瘤-瘤融合细胞因不能合成DNA而死亡。而B细胞和B-B融合细胞在这么离体组织培养条件下，无法生存几天内亦快速死亡。骨髓瘤细胞是HGPRT（磷酸核糖转移酶）缺点型，但B细胞中有这种酶，所以B-瘤融合杂交瘤细胞含有HGPRT酶，可利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶（T）来合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。抗体制药医学知识讲座第28页（2）选择性培养基础方法①将融合反应后细胞悬浮液于HAT培养液，加入到含有喂养细胞96孔板内（0.1ml/孔）。②7天内用HAT培养液培养，每2~3天换液一次。换液时吸去1/2~2/3培养液，加入等量新鲜培养液。③第7~14天改用HT培养液，14天以后用普通RPMI1640完全培养液。④融合后培养第9~11天，就可对全部克隆生长孔培养上清液进行抗体检测，筛出产生抗体阳性克隆。抗体制药医学知识讲座第29页（3）喂养细胞，促进融合细胞生长。单个或少数杂交瘤细胞多半不易存活，通常要加入喂养细胞才能使其繁殖。常见喂养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞（未经免疫脾细胞）和胸腺细胞等。喂养细胞能释放一些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还含有去除死亡细胞和降低支原体污染作用。抗体制药医学知识讲座第30页（七）杂交瘤培养物（阳性克隆）判定与检测经培养而得到杂交瘤细胞，只有一个别细胞可能产生针对特异抗原目标抗体，因抗体产生细胞只占全部脾细胞5%左右。所以，在培养9~11天左右，杂交瘤细胞集落直径达1mm时，就应对其能否分泌抗体进行特异性判定，方便反抗体分泌阳性杂交瘤细胞进行克隆化和扩张。检测时，取上清液二分之一体积用于抗体测定，其余再补加等量HT完全培养基。抗体制药医学知识讲座第31页1、判定与检测方法要求应快速、灵敏、特异性（专一性）强、微量、简便并一次能检测大批标本。抗体制药医学知识讲座第32页2、常见检测方法有①、抗原直接结正当：适合用于检测能与可溶性和颗粒抗原特异结合抗体。②利用第二抗体检测方法：适合用于检测能与可溶性和颗粒抗原特异结合抗体。有酶联免疫法，放射免疫法，免疫电镜技术，免疫荧光技术。抗体制药医学知识讲座第33页（1）抗原直接结正当①选取对应纯一抗原，用125I进行标识，然后和杂交瘤细胞培养上清液混合，在一定温度下反应一定时间（如4℃，1h等）②再经过活性炭吸附、PEG6000沉淀或凝胶层析方法分离未结合抗原，纯化抗体抗原免疫复合物。③最终经过测定其复合物放射性强弱来进行定性和定量测定。抗体制药医学知识讲座第34页（2）利用第二抗体检测第二抗体：能与抗原和抗体发生免疫反应后形成复合物进行特异结合抗体，又称抗抗体抗体制药医学知识讲座第35页应用第二抗体检测杂交瘤分泌抗体时，需采取免疫标识技术。将第二抗体用125I放射性同位素标识，或与酶连接，或与荧光染料连接，或用电子致密物质加以标识，以提升检测准确性和灵敏度。含有应用范围广，反应速度快，轻易观察，且能进行定量和定性检测特点。抗体制药医学知识讲座第36页①免疫荧光技术是利用结合有荧光素第二抗体与抗原抗体免疫复合物特异性结合，再检测荧光强度实现定性定量检测技术。常见荧光素有异氰基荧光素（FIC）、异硫氰基荧光素等。基础原理：荧光素可与第二抗体球蛋白中赖氨酸氨基结合，在蓝紫光激发下发射出鲜明黄绿色或玫瑰红色，而且结合荧光素第二抗体与抗原抗体复合物结合后仍能发出荧光。抗体制药医学知识讲座第37页②酶联免疫技术用酶标识抗体或第二抗体来进行抗原抗体反应或第二免疫反应，检测酶标识抗体或第二抗体是经过酶与特殊底物反应来进行（颜色改变，氧化还原电位改变等）。●通常见酶有：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶等。应用发展最快是酶联免疫吸附法，是检测杂交瘤细胞培养上清液中抗体一个最有效方法。抗体制药医学知识讲座第38页③放射免疫技术是应用同位素标识第二抗体与抗原抗体复合物进行特异结合，再经过检测放射强度来进行定性定量检测抗体方法。含有高灵敏度和血清反应高特异性优点。但需要γ-计数器等检测放射性特殊仪器。抗体制药医学知识讲座第39页④免疫电镜技术：是利用电子致密物质标识第二抗体后再与抗原抗体复合物结合，最终用电子显微镜检测技术。抗体制药医学知识讲座第40页（3）免疫标识技术方法步骤①将特定纯一抗原（20µg/ml）吸附在微量滴定板小孔中（每孔50~100µl抗原溶液），37℃温育2h或4℃过夜，倾去抗原溶液，用DPBS缓冲液洗涤小孔3次，这时小孔上已粘附了特定抗原。②用一个不能与待检测抗体结合蛋白质饱和小孔内剩下蛋白质结合位点（1%牛血清蛋白DPBS缓冲液250µl），然后一样用DPBS缓冲液洗涤小孔3次。抗体制药医学知识讲座第41页③加入待检测杂交瘤培养上清液（每小孔加入上清液50~100µl），在37℃下温育2h，使待测抗体与抗原充分结合。倾去上清液，用DPBS缓冲液洗涤3次。④加入用免疫标识技术标识第二抗体，使其与已形成抗原抗体复合物结合，然后用对应方法检测。抗体制药医学知识讲座第42页如：采取酶联免疫技术每小孔加入50~100µl酶与第二抗体连接物溶液，37℃下反应30min，使第二抗体与抗原抗体复合物结合。然后，再用含0.05%Tween-20DPBS液洗涤小孔5次，再加入50~100µl酶底物溶液，使底物与[抗原-抗体]-第二抗体-酶复合物在一定条件下反应。最终用多用扫描仪在特定波长下测定反应产物光密度，再换算成待测抗体浓度。抗体制药医学知识讲座第43页（八）杂交瘤细胞克隆化筛选出阳性克隆中（细胞集落），可能含有不分泌抗体细胞，或有多株分泌不一样抗体细胞。而且刚融合取得杂交瘤细胞不稳定，染色体易丢失。所以，必须尽早进行克隆化。抗体制药医学知识讲座第44页克隆化：分离取得单细胞并将单细胞经过无性繁殖而取得细胞集团整个过程。这些细胞集团中每个细胞生物学特征和功效是完全相同。普通融合判定后取得杂交瘤细胞集落要经约3次克隆化，才能到达100%孔内均为单克隆抗体阳性细胞。抗体制药医学知识讲座第45页常见克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。1、有限稀释法将杂交瘤细胞集落制成单细胞悬浮液，经稀释到一定细胞浓度后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。经培养、检测和判定后深入分离筛选。抗体制药医学知识讲座第46页①第一次克隆化时要应用HT培养液，以后克隆化可用不含HTRPMI1640培养液。②因为单个细胞难以存活，克隆化培养时需加入喂养细胞辅助其生长。③抗体检测、判别。抗体制药医学知识讲座第47页2、软琼脂法是在培养液中加入0.5%左右琼脂糖凝胶，将杂交瘤集落单细胞悬浮液加入其中，细胞分裂后形成小球样团块。因为培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块经打坏后再制成单细胞悬浮液，移入96孔板中继续培养和判定。用这种方法能够吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化轻易成功。抗体制药医学知识讲座第48页（九）杂交瘤细胞与McAb判定1、杂交瘤细胞判定对杂交瘤细胞进行染色体分析，不但可作为判定指标，还能帮助了解其分泌抗体能力。抗体制药医学知识讲座第49页（1）杂交亲本染色体特点鼠脾细胞染色体数为40，全部是端着丝点染色体。小鼠骨髓瘤细胞染色体数变异较大，SP2/O细胞系为62~68，NS-1细胞系为54~64，大多数为非整倍体性，而且有中部和亚中部着丝点染色体。抗体制药医学知识讲座第50页（2）杂交瘤细胞染色体特点①杂交瘤细胞染色体数目靠近两种亲本细胞染色体数目标总和，在结构上除多数为端着丝点染色体外，还有少数中着丝点或亚中着丝点标志染色体。②染色体数目较多且又比较集中杂交瘤细胞能稳定分泌高效价抗体，而染色体数目少且较分散杂交瘤细胞分泌抗体能力较低。抗体制药医学知识讲座第51页2、McAb判定（1）免疫球蛋白类和亚类判定因为不一样类和亚类免疫球蛋白生物学特征差异较大，所以要对制备杂交瘤细胞所产生McAb进行Ig类和亚类判定。方法：可用羊或免抗Ig不一样类和亚类抗体，进行免疫扩散或酶联免疫吸附试验（ELISA）进行判定。抗体制药医学知识讲座第52页（2）McAb与对应抗原亲和力测定可为正确选择不一样用途McAb提供依据。（3）对McAb进行特异性、纯度和识别抗原相对分子质量等进行测定。抗体制药医学知识讲座第53页（十）单克隆抗体大量制备McAb大量制备有体外培养法和体内诱生法。1、体内诱生法可取得5~20mg/ml抗体，当前多采取。（1）动物选择：选取BALB/C小鼠来制备。抗体制药医学知识讲座第54页（2）基础方法：①在接种杂交瘤细胞前1~2周，先给小鼠腹腔注射0.5ml降植烷（或液体石蜡），以破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞良好增殖环境。②注射1×106杂