肉毒梭状芽孢杆菌检测

肉毒梭状芽孢杆菌检测第1页/共19页梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌属的成员在自然界中是一种非常独特的种类，当其进入到反刍动物体内时，常会引起肌肉和软组织感染、肠道疾病和神经中毒性疾病。梭状芽孢杆菌引起反刍动物发病的机理通常是间接地通过其产生的一种或多种毒素（毒蛋白质）来致病。第2页/共19页梭状芽孢杆菌在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。第3页/共19页梭状芽孢杆菌在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌。第4页/共19页肉毒毒素肉毒毒素（botulinumtoxin，AX）是肉毒杆菌产生的含有高分子蛋白的神经毒素，是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强烈的生物毒素，它主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹是致死的主要原因。第5页/共19页化学结构与理化性质

从1964年由肉毒杆菌中分离出毒素结晶至今已获得七种（A，B，C，D，E，F和G）类型的毒素，能引起人员中毒的主要是A、B和E型毒素，其中以A型军用意义最大，A型结晶毒素是由19种氨基酸组成的单一蛋白质，分子量为90～120万，化学结构目前尚不清楚。肉毒毒素通常是由神经毒素和血凝素组成的复合形式存在。A型肉毒毒素的纯品是一种白色晶体粉末，易溶于水，但稳定性较差。受热、机械力和氧的作用而降解。粉末状的毒素可长期贮存而不失活性，肉毒毒素染毒的食物和水源，一般其毒性可保持数天乃至一周，肉毒毒素不被胃肠液所破坏，易经消化道中毒。第6页/共19页中毒途径与毒性

A型肉毒毒素的气溶胶对人吸入的致死量为0.3μg，LCt50为0.1～0.5mg·min/m3，静脉注射致死量为0.15～0.3μg，口服致死剂量为8～10μg，该毒素对小鼠的毒性LD50值约为3×10–5~3×10–4μg。野外试验表明，由于大规模施放方法尚未解决，肉毒毒素通过呼吸道中毒的致死效应，并不比等量神经性毒剂大。当前以污染食物和水源通过消化道染毒为其主要的中毒途径。另据报道，美军利用肉毒毒素污染小型武器的弹头，以增强杀伤效应，现已生产这种武器。平时主要是摄入被肉毒毒素污染的肉类和罐头等食品而中毒，死亡率大约为25～50％。第7页/共19页中毒机理

业已阐明，在体内肉毒毒素特异性的与胆碱能神经末梢突触前膜的表面受体相结合，然后由于吸附性胞饮而内转进入细胞内称为毒素的内转（internalization），使囊泡不能再与突触前膜融合，从而有效地阻抑了胆碱能神经介质——乙酰胆碱的释放。与此同时，毒素与突触前膜结合，还阻塞了神经细胞膜的钙离子通道，从而干扰了细胞外钙离于进入神经细胞内以触发胞吐和释放乙酰胆碱的能力。乙酰胆碱释放的抑制，有效地阻断了胆碱能神经传导的生理功能，尤其是神经一肌肉接头部位特别敏感，引起全身随意肌松弛麻痹，呼吸肌麻痹是致死的主要原因。第8页/共19页临床表现

肉毒毒素经消化道吸收中毒，一般经过12～72小时的潜伏期，开始出现全身中毒症状。早期症状有恶心、呕吐及腹泻等，继之出现头痛、头昏、眩晕、软弱无力，中毒的重要特征为视力紊乱：复视、斜视、瞳孔散大、视力模糊，同时伴有眼球震颤，这是眼内外肌麻痹的结果。严重病人有吞噬、咀嚼、语言、呼吸等困难，排痰及抬头困难，共济失调等，神志清楚。症状继续发展则出现进行性呼吸困难，全身肌肉松弛性麻痹。继则脉搏加快，血压下降，短时间抽搐，意识丧失，最终因呼吸衰竭、心力衰竭或继发肺炎等而死亡。通过呼吸道吸入中毒，一般症状发展迅速且严重。其他途径中毒的临床症状，因毒剂的剂量不同而异。病人恢复较缓慢，视觉障碍恢复特慢，有时需数月之久。第9页/共19页肉毒梭状芽孢杆菌肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridiumbotulinum）是可形成芽孢、无荚膜、有鞭毛的革兰氏阳性杆菌，可产生对人和动物具有强大毒性的外毒素肉毒毒素。可分为A，B，C（α，β），D，E，F和G7个血清型，对人具有不同程度的致病力。肉毒毒素受高温、碱性条件、日光直射时均可被破坏而不稳定，但在酸性条件下较稳定。引起的中毒是毒素型中毒，毒素作用于中枢神经系统的颅神经核，抑制乙酸胆碱的释放，引起肌肉麻痹。在厌氧的土壤、江河湖海的淤泥沉积物、尘土和动物粪便中有广泛存在，易污染蔬菜、鱼类、肉类、豆类等蛋白质丰富的食品。第10页/共19页肉毒梭状芽孢杆菌肉毒梭状芽孢杆菌为厌氧性革兰氏阳性杆菌，罐装食品中引起腐败的主要菌种，解糖嗜热梭状芽孢杆菌（Cl.thermosaccharolyticum）可分解糖类引起罐装水果、蔬菜等食品的产气性变质。腐败梭状芽孢杆菌（Cl.putrefaciens）可以引起蛋白质食物的变质。肉类罐装食品中最重要的是肉毒梭状芽孢杆菌（Cl.botulinum）,其芽孢产生在菌体的中央或极端，芽孢耐热性极大，能产生很强的毒素。第11页/共19页检验所需器材庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液、肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶、革兰氏染色液等。第12页/共19页检验所需器材离心机及离心管、研钵及细砂、培养箱、显微镜、厌氧培养装置、1ml和10ml吸管、1ml注射器、平皿、接种环、载玻片、小白鼠等。第13页/共19页肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序第14页/共19页肉毒毒素检测操作方法

检样制备检出试验确证试验毒力测定定型试验第15页/共19页肉毒梭菌检验操作方法样品处理增菌培养分离培养第16页/共19页注意事项典型的肉毒中毒，小白鼠会在4~6小时内死亡，而且98%~99%的小白鼠会在12小时内死亡，因此，试验前24小时内的观察是非常重要的。24小时后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。如果小白鼠注射1：2或1：5倍数的稀释样品后死亡，但注射更高稀释度的样品后未死亡，这也是费城可以的现象，一般为非特异性死亡。小白鼠