重组质粒构建专题宣讲

DNA重组质粒构建医学生物所病毒免疫室重组质粒构建专题宣讲第1页基因克隆genecloning应用酶学方法，在体外将目标基因与载体DNA结合成一含有自我复制能力DNA分子（重组体），继而经过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目标基因转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取取得大量同一DNA分子拷贝。关键技术：DNA重组技术

（recombinantDNAtechnique）重组质粒构建专题宣讲第2页基因克隆基本程序：

分—切—接—转—筛PCR酶切连接转化&转染抗性或标识筛选目标基因DNA片段取得外源DNA分子与载体DNA分子体外重组重组DNA分子转移到适当受体菌或细胞重组DNA分子克隆筛选和判定目标基因或其表示产物纯化和判定基因克隆技术特点：

1.可在体外人工,有目标,依据需要进行基因重组、表示、测序、诱变、修复；

2.方法简便、快速、准确、特异，能确保研究与开发需要。重组质粒构建专题宣讲第3页基因克隆示意图重组质粒构建专题宣讲第4页胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体重组质粒构建专题宣讲第5页例：干扰素是治疗癌症主要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家企业用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样干扰素，其详细做法是：从人淋巴细胞中提取能指导干扰素合成基因，并使之与一个叫做质粒DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短时间内大量生产干扰素。利用这种方法不但产量高，而且成本也较低。重组质粒构建专题宣讲第6页DNA重组操作过程载体外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞abbA重组Ab抗性筛选重组筛选重组质粒构建专题宣讲第7页重组质粒构建：目标DNAPCR扩增

DNA片段和载体酶切

片段DNA与载体连接载体：plasmid（primary）工具酶：限制性内切酶

连接酶

重组质粒构建专题宣讲第8页常见基因工程载体载体：用于携带重组DNA，而且能够使外源DNA一起复制与表示运载工具。依据起源：plasmid;phage;viral;BAC;YAC依据用途分：克隆载体；原核生物表示载体；真核生物表示载体依据与宿主关系分：整合性载体、非整合性载体基因工程中用得最多是plasmid载体。下面介绍几个常见载体。重组质粒构建专题宣讲第9页载体基本结构单元：1.复制起点2.克隆位点3.筛选标识其它条件：4.适当大小5.易于操作：包含宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。重组质粒构建专题宣讲第10页质粒(Plasmid)质粒是独立于宿主细胞（如细菌）染色体之外可进行复制和遗传遗传单位-双链闭合环状超螺旋DNA分子。是一个环状双链DNA分子，大小从1K-200Kb。重组质粒构建专题宣讲第11页通常质粒含有一些染色体没有基因，负责编码一些功效蛋白，这些功效并不是细菌生存所必需，但在一定环境下，可对细菌宿主生存有利。由质粒产生表型包含反抗生素抗性（R因子）、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制本身染色体同一组酶系。重组质粒构建专题宣讲第12页重组质粒构建专题宣讲第13页质粒DNA特征质粒复制依赖宿主细胞复制机器，但能够独立复制。（单拷贝或多拷贝：紧密型质粒和松弛型质粒）严紧型：这些质粒复制是在寄主细胞严格控制之下，与寄主细胞复制偶联同时。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒复制是在寄主细胞松弛控制之下，每个细胞中含有10-200份拷贝重组质粒构建专题宣讲第14页不相容质粒携带复制子基本相同，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞过程中相互竞争。质粒DNA所编码基因产物赋予细菌一些性状特征。质粒并非细菌生存所必不可少遗传物质，能够在细菌间转移与丢失。质粒可自行失去或经人工处理而消失可有几个质粒同时共存在于一个细菌内，但同群质粒有不相容性（同群质粒含有同源性，能够产生相同阻遏蛋白，故彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞）重组质粒构建专题宣讲第15页（四）人工构建质粒基本元件启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制抗性基因：用于筛选阳性克隆。多克隆位点：插入外源基因。对于表示载体还需要开启子、多聚A尾等.易于操作：包含宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。重组质粒构建专题宣讲第16页pBR322plasmid是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本要求都具备：复制起点:Ori克隆位点:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI筛选标识:Ampr。重组质粒构建专题宣讲第17页T-vectorPCR产物亚克隆载体重组质粒构建专题宣讲第18页T—Vector是一个高效克隆PCR产物(TACloning)专用载体，由pUC18载体改建而成。在pUC18载体多克隆位点处XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物3’末端添加一个“A”特征,所以用本制品可大大提升PCR产物连接、克隆效率。

T-vector克隆PCR产物时用高效连接液LigationSolutionI能够在极短时间内(30分钟～1小时)完成连接反应，大大地方便了试验操作。用途克隆PCR产物。对克隆后PCR产物使用M13primers进行DNA测序。重组质粒构建专题宣讲第19页重组质粒构建专题宣讲第20页

原核生物表示载体Bacterialexpressionvector重组质粒构建专题宣讲第21页复制起点克隆位点筛选标识开启子﹡转录终止序列﹡核糖体结和位点：起始密码子ATG和SD序列（翻译识别）原核生物表示载体基本结构单元包含：重组质粒构建专题宣讲第22页重组质粒构建专题宣讲第23页重组质粒构建专题宣讲第24页

真核生物表示载体（mammalianexpressionvector)重组质粒构建专题宣讲第25页真核生物表示载体结构单元复制起点（真核和原核）克隆位点筛选标识(原核和真核标识）增强子/开启子﹡PolyA﹡终止信号重组质粒构建专题宣讲第26页重组质粒构建专题宣讲第27页LocationofFeaturesPCMVIE:

CMVIEenhancer:1-659

CMVIEpromoter:669-750Interveningsequence(IVS):890-1022T7RNApolymerasepromoter:1067-1085Multiplecloningsite:1085-1137T3RNApolymerasepromoter:1158-1137SV40fragmentcontainingpolyadenylationsignal:1167-1388f1originofreplication:1483-1938重组质粒构建专题宣讲第28页EGFPexpressioncassette:-3455SV40enhancer/earlypromoter:-2420

EGFPstructuralgene:2449-3168

Kozakconsensustranslationinitiationsite:2442-2452

Startcodon(ATG):2449-2451;Stopcodon:3166-3168

InsertionofValatposition2:2452-2454

GFPmut1chromophoremutations(Phe-64toLeu;Ser-65toThr):2731-2735

His-231toLeumutation(A-->T):3143

Bovinegrowthhormone(BGH)genefragmentcontainingpolyadenylationsignal:3182-3455SV40originofreplication:2318

Ampicillinresistance(b-lactamase)gene:3449-4709

Startcodon(ATG):3849-3451

Stopcodon(TAA):4707-4709重组质粒构建专题宣讲第29页噬菌体载体λ噬菌体(λphage)外源DNA：9~23kb惯用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：λDNA

cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kbM13噬菌体重组质粒构建专题宣讲第30页重组质粒构建专题宣讲第31页重组质粒构建专题宣讲第32页λ噬菌体(λphage)

特点：一个能感染大肠杆菌病毒，野生型为双链线状DNA分子，长度48.5kb,分子两端各有一个12bp组成粘性末端,感染大肠杆菌后,线状DNA经过粘性末端互补连接成环,连接处称COS位点。

1.本身有复制体系;2.中间(J-N间)是λ生长非必需区,可被其它外源DNA取代;

重组质粒构建专题宣讲第33页

3.λDNA在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高;4.载体容量大,可装入大片段外源DNA(20kb);5.可人工加入多克隆位点;6.筛选轻易——噬菌斑筛选;7.主要用于DNA文库构建.重组质粒构建专题宣讲第34页插入型载体——含单一限制性酶切位点，可接收10kb以下外源片段，可用于cDNA文库构建；取代型载体——含某一限制性酶两个切点，可接收20kb左右外源片段，可用于基因组DNA文库构建。重组质粒构建专题宣讲第35页重组质粒构建专题宣讲第36页粘性质粒(cosmid)

是一个人工改造载体,双链环状DNA，含有λDNA

cos区+质粒，克隆容量：40~50kb

1.λ-DNACOS位点;

2.质粒复制起点和抗药性标识(Ampr);

3.各种单一酶切位点.

重组质粒构建专题宣讲第37页cosmid较小,约4–6kb,可容纳40-45kb外源DNA,因为噬菌体DNA包装时包装蛋白识别只是DNA粘性末端附近一小段次序，所以只要一个质粒接上此粘性末端次序，再加上外源DNA片段使其长度为野生型DNA大小75－105%，重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选.重组质粒构建专题宣讲第38页重组质粒构建专题宣讲第39页优缺点:

1.克隆效率高;

2.可利用质粒DNA方式扩增;

3.可克隆较大DNA片段;

主要用于真核基因克隆,基因组文库构建

4.缺点:产生串联现象。

重组质粒构建专题宣讲第40页M13噬菌体

一个丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA转变为dsDNA,可用作克隆载体.

最大优点：产生单链DNA,可制备单链DNA探针.

重组质粒构建专题宣讲第41页重组质粒构建专题宣讲第42页构建基因文库克隆载体粘粒(Cosmid)细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC)P1噬菌体人工染色体(PAC)重组质粒构建专题宣讲第43页P1及YAC载体

酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体着丝粒和自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒Tel序列，选择性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中稳定复制，惯用于大染色体基因组DNA文库构建。重组质粒构建专题宣讲第44页一个经典YAC系列载体重组质粒构建专题宣讲第45页病毒载体

DNA病毒在细胞中含有较高拷贝数，并有较强开启子，因而是基因工程载体理想候选者。诸如：SV40（猴肾病毒）Epstein-Barr病毒(EBV病毒)牛乳头瘤病毒（BPV）昆虫杆状病毒（baculovirus)重组质粒构建专题宣讲第46页重组质粒构建专题宣讲第47页因为存在容量小、宿主范围小等缺点，天然SV40病毒作为载体极少被使用，多数载体为带有来自SV40中转录元件质粒型载体SV40增强子、开启子和复制子，能够在哺乳动物细胞中产生高效组成型表示。SV40polyA信号，能够对转录产物进行加工，稳定转录产物活性。Zeocin抗性基因，可作为大肠杆菌及哺乳动物细胞选择标识。Zeocin抗性基因在大肠杆菌中合成由EM-7开启子控制，在哺乳动物细胞中表示由CMV开启子控制，既可用于瞬时表示，也可用于筛选稳定表示细胞系。f1复制子，可产生单链DNA。ColE1复制起始位点，使质粒可在大肠杆菌中复制扩增。重组质粒构建专题宣讲第48页EB病毒EB病毒重组质粒构建专题宣讲第49页Epstein-Barr病毒(EBV病毒)是人类疱疹病毒,可转化人B淋巴细胞，在转化细胞中以染色体外附加体形式存在。EBV病毒顺式作用因子oriP能够在带有EBVDNA并表示含有反式作用EBNA－1抗原贴壁细胞中维持附加体DNA分子存在，因而能作为构建表示载体元件，该类载体也主要用于建立带有多拷贝外源基因细胞系。可在各种细胞中表示，可表示基因组DNA和cDNA,可为表示细胞系。重组质粒构建专题宣讲第50页ComparisonofdifferentcloningvectorsVectortypeLengthofclonedDNAPlasmid20kbPhageλ25kbCosmid45kbP1vector100kbBAC100Kb(bacterialartificialchromosome)YAC1,000kb(yeastartificialchromosome)重组质粒构建专题宣讲第51页DNA重组操作过程载体外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞abbA重组Ab抗性筛选重组筛选重组质粒构建专题宣讲第52页一把特殊剪刀—限制性内切酶30多年前，当人们在对噬菌体宿主特异性限制-修饰现象进行研究时，首次发觉了限制性内切酶。细菌能够抵抗新病毒入侵，而这种“限制”病毒生存方法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接基因片段。研究者很快发觉内切酶是研究基因组成、功效及表示非常有用工具。阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖重组质粒构建专题宣讲第53页限制性内切酶特点：限制性内切酶形式多样，从大小上来说，它们能够小到如PvuII（157个氨基酸），也能够比1250个氨基酸CjeI更大除了一些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发觉在已纯化分类3000种限制性内切酶中，已发觉了超出250种特异识别序列。重组质粒构建专题宣讲第54页限制性内切酶命名限制性内切酶命名次序以下：A用3个字母代表起源生物，如大肠杆菌（

Escherichiacoli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。B1个字母或阿拉伯数字代表菌株（EcoR、Hind）C1个罗马字母代表发觉或判定次序（EcoRI、HindIII）重组质粒构建专题宣讲第55页限制性内切酶分类按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等原因限制性内切酶可划分为三大类：I型限制性内切酶II型限制性内切酶III型限制性内切酶重组质粒构建专题宣讲第56页I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性多个亚基蛋白复合体。其特点是识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点。它们在识别位点很远地方任意切割DNA链，不产生确定限制片段和明确电泳条带，因而不具备实用性。III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功效酶。即使有特异切割位点，但它们在识别位点之外切开DNA链，极少能产生确定切割片段，因而不具备实用价值，也没有些人将其商业化。重组质粒构建专题宣讲第57页II型限制性内切酶在其识别位点之中或临近确实定位点特异地切开DNA链。它们产生确定限制片段和跑胶条带，所以是三种限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆一类。II型限制性内切酶由一群性状和起源都不尽相同蛋白组成，因而任意一个限制性内切酶氨基酸序列可能与另一个限制性内切酶氨基酸序列截然不一样。实际上，从已知情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生，而非起源于同一个祖先。重组质粒构建专题宣讲第58页II型限制性内切酶中最普遍是象HhaI、HindIII和NotI这么在识别序列中进行切割酶。这一类酶是组成商业化酶主要部分。大部分这类酶都以同二聚体形式结合到DNA上，因而识别是对称序列；但有极少酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续序列（如EcoRI识别GAATTC）；而另一些识别不连续序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶切割后产生一个3‘羟基端和一个5’磷酸基团。它们活性要求镁离子存在，而对应修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷存在。这些酶普通都比较小，亚基普通都在200-300个氨基酸左右。重组质粒构建专题宣讲第59页一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同识异切酶消化星号活力重组质粒构建专题宣讲第60页限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：

钝性末端(bluntend)粘性末端(stickyend)重组质粒构建专题宣讲第61页同尾酶有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同粘性末端，这类酶被称为同尾酶，能够经过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新酶切位点。如XbaⅠ(T`CTAGA)、NheⅠ(G`CTAGC）、SpeⅠ(A`CTAGT)切割DNA序列不一样，但均给出相同“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上酶将不能再切割，但却产生了一个新4核苷酸酶切位点，即BfaⅠ（C`TAG)酶切位点。重组质粒构建专题宣讲第62页有时两种限制性内切酶识别核苷酸次序和切割位置都相同，其差异只在于当识别次序中有甲基化核苷酸时，一个限制性内切酶能够切割，另一个则不能。比如HpaⅡ和MspⅠ识别次序都是5’……CCGG……3’，假如其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。同裂酶重组质粒构建专题宣讲第63页限制性内切酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似序列。星号活性识别形式常对标准识别次序中两侧碱基没有特异性。所以,尽可能采取规范试验步骤,应用推荐反应条件。星号活力重组质粒构建专题宣讲第64页克隆（有时与甲基化酶联用）判定（基因片断大小、正反向）检测突变（识别位点，限制酶切图谱多态性RFLP）制作Marker限制性内切酶应用重组质粒构建专题宣讲第65页限制性内切酶使用一个标准酶切反应包含：DNA适当酶缓冲液蛋白酶为了提升酶切效率，可加入BSA。重组质粒构建专题宣讲第66页1、建立一个标准酶切反应通常，10个单位内切酶能够切割1μg不一样起源和纯度DNA。一个50μl反应体系中，1μl酶在1XBuffer终浓度及对应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好DNA。假如加入更多酶，则可对应缩短反应时间；假如降低酶用量，对许多酶来说，对应延长反应时间（不超出16小时）也可完全反应。普通说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2单位酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位酶。应用中注意点重组质粒构建专题宣讲第67页2.选择正确酶不言而喻，选择酶在底物DNA上必须最少有一个对应识别位点。内切酶产物能够是粘端（3'或5'突出端），也能够是平端片段。粘端产物能够与相容其它内切酶产物连接，而全部平端产物都能够相互连接重组质粒构建专题宣讲第68页3、加酶内切酶一旦拿出冰箱后应该马上置于冰上。酶应该是最终一个被加入到反应体系中（在加入酶之前全部其它反应物都应该已经加好并已预混合）。酶用量视在底物上切割频率而定。重组质粒构建专题宣讲第69页4、DNA

待切割DNA应该已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子污染，以免干扰酶活性。DNA甲基化也应该是酶切要考虑到原因重组质粒构建专题宣讲第70页5、缓冲液对于每一个酶都提供对应最正确缓冲液，可确保酶活性。使用时缓冲液浓度应为1X。有酶要求100μg/mlBSA以实现最正确活性。不需要BSA酶假如加了BSA也不会受太大影响重组质粒构建专题宣讲第71页6、反应体积内切酶活力单位定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg底物DNA所需酶为一个活力单位。所以酶：DNA反应百分比能够由此确定。较小反应体积更轻易受到移液器误差影响。为了将甘油浓度控制在5%以下，要注意酶体积不要超出总体积10%（普通酶都贮存于50%甘油中）重组质粒构建专题宣讲第72页7、混合这是非常主要然而经常被忽略一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪重复吸收混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！重组质粒构建专题宣讲第73页8、反应温度大部分酶反应温度为37℃；从嗜热菌中分离出来内切酶则要求更高温度。普通为50-65℃不等重组质粒构建专题宣讲第74页9、反应时间

1酶活单位定义时间为1小时。假如加入酶较多，能够对应地缩短反应时间；反之，假如加入酶量较少，也能够延长时间以使反应到达完全重组质粒构建专题宣讲第75页10、终止反应假如不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。我们使用以下反应终止液：50%甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。假如要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65℃或85℃，20分钟）。热失活并不能适合用于全部酶。另外，酚/氯仿抽提也能够用于终止反应。重组质粒构建专题宣讲第76页11、贮存大部分酶应贮存于-20℃。少部分酶则须在-70℃长久保留。10XBUFFER和100XBSA于-20℃保留。BSA不能与Buffer混合后保留，不然将会出现BSA沉淀重组质粒构建专题宣讲第77页12、稳定性大部分酶在推荐保留缓冲液里在-20℃条件下十分稳定。高于-20℃条件下稳定性将有所降低重组质粒构建专题宣讲第78页13、对照反应假如发觉DNA底物不能被成功切开，能够进行对照试验以查明原因。详细方法以下：将不加内切酶底物DNA（待切底物）与加入了内切酶对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若试验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若试验结果发觉底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则能够排除酶质量原因，此时能够将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。假如有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里对照DNA也无法被切开重组质粒构建专题宣讲第79页使用限制性内切酶普通步骤A）测试酶切DNA量B）计算完全酶切所需酶量。为使终体积中甘油浓度低于8%，计算能加酶量，最多能加终体积10%（甘油浓度为5%）。C）10X反应液体积应为终体积1/10；10X反应液体积不应小于酶体积。D）加入计算好DNA，10X反应液，酶。加入水到终体积（20-50ul），轻轻混匀，在适当温度下保温。普通酶最适温度为37oC，但有例外。应查讯分析说明。重组质粒构建专题宣讲第80页举例质粒DNA（2ug/ul）5ul10X反应液5ul内切酶2uldH2O38ul总体积50ul37oC保温2-3小时。应最终加酶。重组质粒构建专题宣讲第81页提升限制性核酸内切酶对低纯度DNA制剂反应效率，可采取方法增加限制性核酸内切酶用量，平均每微克底物DNA可高达10个活性单位甚至更多些。扩大酶催化反应体积，使潜在抑制原因被对应稀释。延长酶催化反应保温时间。重组质粒构建专题宣讲第82页能否在一次反应中用很多限制性内切酶？能够，普通而言，甘油浓度超出8%对酶切有抑制。有些酶在高甘油浓度中会产生星号活力。限制性内切酶提供在50%甘油中，故10ul反应体积中不应加入超出1.6ul酶。重组质粒构建专题宣讲第83页6.双酶切：依据重组需要，有时需要用双酶切（单酶切：因为只有一个酶切，载体片段很轻易相互粘连，形成空载体），这么重组效果会更加好。双酶切时要先分析两种酶且条件，依据两种酶切缓冲液要求，有三种情况兼容性

处理完全兼容同时加2种酶进行酶切完全不兼容先用一个酶切，沉淀洗盐，再用另一个酶切相对兼容（其中一个酶活性相对较低）同时加2种酶进行酶切只是盐离子浓度不一样先用低离子要求酶切，再补加酶和盐。重组质粒构建专题宣讲第84页7.载体酶切：酶切条件与外源DNA没有区分。载体多位环状DNA,假如只有一个酶切位点，用单酶切。当前商业化载体都有多克隆位点，含有多个酶切位点，能够进行各种选择和取舍。重组质粒构建专题宣讲第85页酶切产物回收离心柱回收纯化酶切产物DNA片段纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很轻易割下大块胶，影响纯化效率。现在柱式纯化号称能够祛除引物，既然如此，酶切掉几个碱基必定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物纯化均可应用柱式纯化。重组质粒构建专题宣讲第86页数据库

限制性内切酶数据库/rebase

其中含有已知全部限制性内切酶完整表，包含识别序列，甲基化敏感性，商业信息和参考文件。Company:TAKARAFermentas

重组质粒构建专题宣讲第87页连接酶（ligase)主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。催化相邻DNA链5’-P和3’-OH末端以磷酸二酯键结合。E.coliDNA连接酶催化