结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究专家讲座

各位老师好！结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第1页

结直肠癌c-erbB-2、CD44v6

及nm23表示与临床病理特征及预后相关性研究

硕士硕士张建兵导师陈莉教授

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第2页引言结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第3页

肿瘤复发和转移是当今肿瘤治疗最棘手问题之一。据统计，有90%以上癌症病人死于肿瘤复发或转移。研究肿瘤细胞转移分子基础及其与癌基因及抑癌基因关系，已成为当前肿瘤防治研究热点问题。真核细胞增殖调控是一个多原因、多步骤、包括到细胞内众多分子事件复杂过程。在细胞增殖调控中，大多数癌基因是促进与发挥正调作用，而抑癌基因则是抑制与负调作用。它们在正常细胞中可能有调整细胞正常生长、抑制肿瘤形成作用，它们失活或缺失会造成细胞增殖失控或癌变。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第4页

癌基因c-erbB-2又称为neu或HER-2。c-erbB-2编码分子量为185ku穿膜蛋白，与表皮生长因子受体（EGFR）同源，该蛋白能够抑制酪氨酸激酶活性，c-erbB-2过分表示和扩增可见于各种肿瘤。已经有很多研究表明，乳腺癌c-erbB-2高水平表示经常与较大原发瘤体积、较多腋下淋巴结转移及较差内分泌治疗反应性相关，预示着更早、更多术后复发及较短生存期｛1，2｝。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第5页

粘附分子CD44是淋巴细胞一个归巢受体，为高度异质性单链跨膜糖蛋白，参加细胞与细胞间、细胞与基质间粘连，有标准型（CD44s）和变异型（CD44V）两型。据报道，其变异体CD44v6过表示与结直肠癌侵袭能力相关｛3，4｝。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第6页核苷二磷酸激酶（NDPK/nm23）属NME基因家族，被认为参加了同恶性肿瘤转移相关各种调整活动。nm23异常改变首先可引发微管聚合而成纺锤体异常，造成非整倍体形成；另首先可经过细胞骨架及细胞素等信号反应性改变引发细胞运动，从而参加侵袭和转移过程。研究发觉啮齿动物试验性肿瘤转移能力与nm23基因表示呈亲密负相关｛5｝，Bertheau等｛6｝在甲状腺恶性肿瘤中研究证实nm23及基因产物表示与肿瘤转移和预后相关密集，nm23mRNA下调与肿瘤淋巴结转移和低生存率相关。

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第7页结直肠癌（colorectalcarcinoma）是人类常见恶性肿瘤之一，对人类健康组成了极大威胁。近年来对结直肠癌相关基因产物检测已逐步和早期诊疗、发病机制、病理特征、预计预后等亲密联络起来，但研究结果不尽一致[7-10]。当前分子病理学研究认为，结直肠癌发生是个多阶段、多原因作用过程，主要是因为癌基因激活、抑癌基因及DNA修复基因突变或功效缺失所致。我们应用免疫组织化学方法同时检测结直肠癌中癌基因蛋白c-erbB-2、CD44v6及nm23表示，并探讨其与病理特征和临床预后相关性。

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第8页材料和方法结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第9页1.1材料1.1.1临床资料：92例结直肠癌：28例：有十年以上随访结果64例：无随访结果以上病例均为结直肠原发性腺癌，不含腺瘤癌变病例，都只作了结直肠癌根治手术，未作化疗、放疗等辅助治疗。男性49例，女性43例，年纪24～75岁（中位55岁）。结肠癌27例，直肠癌65例。依据国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准[11]（见表1）作临床分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期28例，Ⅲ期37例，Ⅳ期8例。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第10页表1UICC结直肠癌TNM分期标准

A.

TNM定义

分期描述原发肿瘤（T）Tx原发肿瘤资料不详T0原发灶不能确定Tis原位癌T1肿瘤侵入粘膜下层T2肿瘤侵入肌层

.T3肿瘤穿过肌层到浆膜下或至无腹膜结肠周围或直肠周围组织T4肿瘤穿过脏层腹膜或直接侵入其它器官组织结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第11页表1UICC结直肠癌分期

A.

TNM定义

分期描述区域淋巴结（N）

Nx区域淋巴结资料不详No无淋巴结转移N1肿瘤转移至1—3个结肠（直肠）周围淋巴结N2肿瘤转移至≥4个结肠（直肠）周围淋巴结N3肿瘤转移至主要血管沿途任何淋巴结结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第12页表1UICC结直肠癌分期

A.

TNM定义

分期描述远处转移（M）

Mx不能确定有没有转移M0无远处转移M1有远处转移

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第13页表1UICC结直肠癌分期

B.

分期标准期别TNM

0TisN0M0

ⅠT1,T2N0M0

ⅡT3,T4Ｎ0Ｍ0

ⅢＡnyＴＮ1,Ｎ2,Ｎ3Ｍ0ⅣＡnyＴＡnyＮＭ1

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第14页1.1.2病理资料：92例结直肠癌中，高分化腺癌16例，中分化腺癌45例，低分化腺癌21例，粘液腺癌10例。对全部病例观察了镜下肿瘤生长方式（推进式为主34例，图1；浸润性为主58例，图2）以及瘤周淋巴样细胞聚集情况（21例见有大量淋巴样细胞浸润，图3；71例无大量淋巴样细胞浸润，图2）。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第15页结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第16页结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第17页结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第18页1.1.3主要试剂及试验材料：

c-erbB-2单克隆抗体（克隆系TAB250），工作浓度1：100；CD44v6单克隆抗体（克隆系2F10）,工作浓度1：100；nm23单克隆抗体（克隆系M-0421），工作浓度1：80。抗原修复液为0.01M、PH6.0枸橼酸盐缓冲液，DAB显色。以上试剂、二抗及SP试剂盒均为DAKO企业产品。免疫标识阳性对照组织来自乳腺癌、胃癌。

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第19页

1.2方法

1.2.1标本及玻片处理：全部标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，3～4μm连续切片。每例选取四张切片贴于经多聚赖氨酸处理玻片上，70oC烘烤2小时，1张进行HE染色，其余3张进行免疫组织化学染色。

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第20页1.2.2HE染色：

主要步骤：

石蜡切片脱蜡梯度乙醇水化苏木素染色盐酸乙醇分化返蓝伊红染色梯度乙醇脱水透明封固

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第21页1.2.3c-erbB-2、CD44v6及nm23免疫组织化学染色：

主要步骤：石腊切片脱蜡至水去内源性酶抗原修复（高压锅煮沸放气3分钟,nm23不需）一抗二抗SP复合物DAB显色水洗，苏木素复染，封片。

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第22页1.1.2.4免疫组织化学检测结果分析方法：

c-erbB-2、CD44v6阳性定位在细胞膜出现棕黄色颗粒，nm23阳性定位在细胞浆出现棕黄色颗粒。着色细胞＜10%为阴性，＞10%为阳性。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第23页1.2.5统计学处理方法：

利用Stata7.0统计软件（美国计算机资源中心研制）进行统计学处理。不一样组间表示率比较采取Fisher准确检验；对有随访结果病例用Cox百分比风险模型进行单原因和多原因生存分析，并对有预后意义指标作出Kaplan-Meier生存曲线。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第24页结果结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第25页2.1结直肠癌癌基因蛋白表示与临床病理参数关系

92例结直肠癌中，44例c-erbB-2阳性（图4、5），阳性率47.8%；51例CD44v6阳性（图6、7），阳性率55.4%；39例nm23阳性（图8、9），阳性率42.4%。c-erbB-2、CD44v6及nm23表示与组织分型、UICC分期、肿瘤生长方式及瘤周淋巴样细胞浸润关系见表2。

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第26页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 NC-erbB-2

阴性

阳性

阳性率%

组织类型高分化腺癌1610637.5中分化腺癌45232248.9低分化腺癌2191257.1粘液腺癌106440.0 p=0.658

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第27页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 NCD44V6

阴性

阳性

阳性率%

组织类型高分化腺癌168850.0中分化腺癌45212453.3低分化腺癌2171466.7粘液腺癌105550.0p=0.696

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第28页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 Nnm23

阴性

阳性

阳性率%

组织类型高分化腺癌169743.8中分化腺癌45271840.0低分化腺癌2113838.1粘液腺癌104660.0p=0.690

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第29页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 NC-erbB-2

阴性

阳性

阳性率%

UICC分期

Ⅰ、Ⅱ期47311634.0

Ⅲ期37152259.5Ⅳ期8 2675.0

p=0.018*

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第30页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 NCD44V6

阴性

阳性

阳性率%

UICC分期

Ⅰ、Ⅱ期47281940.4Ⅲ期37102773.0Ⅳ期8 3562.5

p=0.009**

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第31页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 Nnm23

阴性

阳性

阳性率%

UICC分期

Ⅰ、Ⅱ期47291838.3Ⅲ期37181951.4Ⅳ期 86225.0p=0.300

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第32页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 NC-erbB-2

阴性

阳性

阳性率%

肿瘤生长方式

推进式为主34211338.2

浸润性为主58273153.4 p=0.197

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第33页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 NCD44V6

阴性

阳性

阳性率%

肿瘤生长方式

推进式为主34171750.0浸润性为主58243458.6p=0.516

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第34页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 Nnm23

阴性

阳性

阳性率%

肿瘤生长方式

推进式为主34231132.4浸润性为主58302848.3p=0.190

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第35页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 NC-erbB-2

阴性

阳性

阳性率%

瘤周淋巴样细胞浸润有大量淋巴样细胞浸润2116523.8

无大量淋巴样细胞浸润71323954.9

p=0.014*

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第36页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 NCD44V6

阴性

阳性

阳性率%

瘤周淋巴样细胞浸润有大量淋巴样细胞浸润2113838.1

无大量淋巴样细胞浸润71284360.6 p=0.084

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第37页表2C-erbB-2、CD44v6、nm23表示与结直肠癌临床病理参数关系 Nnm23

阴性

阳性

阳性率%

瘤周淋巴样细胞浸润有大量淋巴样细胞浸润21111047.6无大量淋巴样细胞浸润71422940.8 p=0.622

注：p为Fisher准确检验值*示P＜0.05**示P＜0.01

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第38页由表2可见，c-erbB-2表示与UICC分期及瘤周淋巴样细胞浸润相关（P＜0.05），而与组织分型及肿瘤生长方式无显著关系。CD44v6表示与UICC分期相关（P＜0.01），而与其余参数无关。nm23表示与上述各项参数间均无显著关系。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第39页2.2结直肠癌单原因和多原因生存关系分析随访十年以上28例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表示与随访结果见表3。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第40页表328例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表示与生存资料

生存时间（例）＜5年（%）5—（%）＞（%）组织类型高、中分化腺癌（20）3(15.0)10(50.0)7(35.0)低分化、粘液腺癌（8）6(75.0)2(25.0) 0UICC分期

Ⅰ、Ⅱ期（17）2(11.8)8(47.0)7(41.2)

Ⅲ、Ⅳ期（11） 7(63.6)4(36.4)0

肿瘤生长方式

推进式（10）2(20.0)3(30.0)5(50.0)

浸润性（18） 7(38.9)9(50.0) 2(11.1)结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第41页表328例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表示与生存资料生存时间（例）＜5年（%）5—（%）＞（%）瘤周淋巴样细胞浸润

有大量淋巴样细胞（6）02(33.3)4(66.7)

无大量淋巴样细胞（229(40.9) 10(45.5)3(13.6)

c-erbB-2

－(16)2(12.5)7(43.75)7(43.75)

＋(12) 7(58.3)5(41.7) 0

CD44v6

－(14)4(28.6)3(21.4)7(50.0)

＋(14) 5(35.7)9(64.3)0

nm23

－(15)7(46.7)7(46.7)1(6.6)

＋(13)2(15.4) 5(38.5)6(46.1)

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第42页对表3进行单原因Cox模型分析，结果见表4。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第43页表4.结直肠癌单原因生存分析(Cox百分比风险模型)结果

风险比 标准误 z统计量 P值 95％可信区间组织分型4.316485 2.070272 3.05 0.002 1.686075 11.05054UICC分期6.15839 3.069948 3.65 0.000 2.318166 16.36025

肿瘤生长方式3.2363921.6779922.27 0.0231.171477 8.941054瘤周淋巴样细胞浸润5.9772814.484426 2.38 0.017 1.373706 26.00839c-erbB-25.519218 2.756547 3.42 0.001 2.073714 14.68947CD44v62.5768881.232054 1.98 0.048 1.009535 6.577633nm23 .2552479.1230412 -2.83 0.005 .0992302 .6565691

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第44页由表4可见，结直肠癌组织分型、UICC分期、肿瘤生长方式、瘤周大量淋巴样细胞浸润及c-erbB-2、CD44v6、nm23表示均与预后相关（P＜0.05）。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第45页对表3进行多原因Cox模型分析结果见表5

表5.结直肠癌多原因生存分析(Cox百分比风险模型)结果

风险比标准误z统计量P值95％可信区间UICC分期10.888776.412644.050.0003.433109 34.53587c-erbB-25.7247493.212325 3.110.0021.905997 17.19454nm23 .3072231.1580824 -2.290.022.1120639.8422513

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第46页由表5可见，只有UICC分期、c-erbB-2和nm23表示含有独立预后意义（P＜0.05），即UICCⅢ、Ⅳ期，c-erbB-2过表示及nm23表示降低与结直肠癌不良预后相关（图1a-3a）。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第47页结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第48页结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第49页结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第50页讨论结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第51页3．1c-erbB-2表示及其意义

C-erbB-2癌基因位于17号染色体q21区带上，与表皮生长因子受体（EGFR）基因含有同源性，编码含有抑制酪氨酸激酶活性穿膜蛋白（分子量185ku）。经过分析肿瘤细胞中c-erbB-2基因在DNA、mRNA或其产物不一样水平上质和量改变与肿瘤侵袭转移表型之间相关性，或经过基因转染使转染肿瘤细胞取得转移能力试验，已证实该基因与一些肿瘤进展和转移相关。

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第52页

当前已经有较多证据表明c-erbB-2基因过表示与乳腺癌较差预后相关｛1，2｝，但相关该基因与结直肠癌关系研究较少。Yamaguchi等｛12｝和Yang等｛13｝报道发生肝转移结直肠癌c-erbB-2蛋白阳性率显著高于无肝转移结直肠癌。Nakae等｛14｝报道c-erbB-2蛋白阳性率在DukesD期显著高于DukesA、B、C期。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第53页本组92例结直肠癌免疫酶标结果显示，c-erbB-2阳性率与UICC分期呈正相关（P＜0.05）,与瘤周大量淋巴样细胞浸润呈负相关（P＜0.05）,但与组织类型及肿瘤生长方式无显著相关性(P＞0.05)｛13,15｝。对有以上随访资料28例结直肠癌研究表明,c-erbB-2阴性者5年生存率(87.5%)显著高于c-erbB-2阳性者(41.7%,P<0.05)，而且经作多原因Cox回归模型分析提醒，c-erbB-2过表示与结直肠癌不良预后相关。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第54页3．2CD44v6表示及其意义CD44是分布极为广泛细胞表面跨膜糖蛋白分子,主要参加细胞-细胞、细胞-基质之间特异性粘附过程。人类CD44基因定位于11号染色体短臂，全长约50kb，共由20个高度保守外显子组成。外显子按照转录方式不一样可分为组成型外显子（c）和变异性拼接外显子(v)两大类,变异性拼接外显子共有10个,其中较为主要第6位变异性拼接外显子(CD44v6)过分转录已被发觉与一些上皮性肿瘤进展和转移相关。

结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第55页

有作者报道CD44v6过表示结直肠癌易于转移[3，4],还有作者报道CD44V6表示降低与结直肠癌更强侵袭性和不良预后相关[9，16，17]，但Morrin等[10]和Jungling等[18]最近报道认为CD44v6表示与结直肠癌进展没有显著关系。本组92例结直肠癌进行CD44v6标识阳性率与UICC分期之间含有相关性（P<０.01），即Ⅲ、Ⅳ期CD44v6阳性率显著高于Ⅰ、Ⅱ期，但Ⅲ期阳性率（73.0%）却高于Ⅳ期（62.5%）。另外，CD44v6表示与组织类型、肿瘤生长方式及瘤周淋巴样细胞浸润间无显著相关性。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第56页

在有以上随访资料28例结直肠癌中，CD44v6表示与生存率间无显著相关性。Weg-Remers等[17]及Chun等[19]研究表明，CD44v6在正常结肠粘膜内极少表示，而在结直肠癌组织中阳性率显著增高。所以，CD44基因可能只是在结直肠癌肿瘤形成过程中发挥一定作用[9,19]。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第57页3．3nm23表示及其意义人类nm23基因定位于17号染色体长臂（17q21），该基因全长8.5Kb，由5个外显子及4个内含子组成，编码蛋白质分子量约17000（17KDa）。nm23基因产物NDPK与微管聚集、G蛋白信号传递、细胞与周围组织粘附力、完整基底膜形成及转录调整等相关｛20，21｝。现已发觉nm23基因主要有H1、H2两种类型，多数研究认为H1亚型与肿瘤转移关系最亲密。在人类肿瘤中，该基因改变有基因丢失、突变、表示异常｛22｝..结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第58页起初，人们经过动物试验发觉nm23基因含有抑制肿瘤转移作用，以后不少研究报道结直肠癌中nm23表示降低与肿瘤晚期及远处转移相关[23-25]，而且Tannapfel等[26]研究认为nm23表示降低可作为评价结直肠癌含有淋巴结转移潜能一项独立指标。Cheah等[27]报道nm23表示与结直肠癌临床分期呈反比（分期越晚，表示越少），但与性别、年纪、肿瘤分化程度及5年生存率等无显著关系。结直肠癌表达与临床病理特征及预后的相关性研究第59页最近，Katakura等[28]报道nm23表示可作为预测非小细胞肺癌良好预后一项独立指标，但Forte等[29]认为nm23尚不能作为结直肠癌一项独立预后指标。本组92例结直肠癌nm23表示与组织类型、UICC分期、肿瘤生长方式及瘤周淋巴样细胞浸润均无显著相关性，但经对有随访结果结直肠癌中nm2