PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座

PCR-SSP检测HLA-B27

一、试验目标

掌握HLA基因分型原理，学习PCR-SSP基因分型方法。二、试验原理

编码HLA基因含有高度多态性，每一个基因座位上有众多复等位基因，而每一个等位基因都有其各自DNA序列，所以可用对应序列特异性引物（sequencespecificprimers，SSP）进行扩增。经过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其对应等位基因，而不扩增其它等位基因。

PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第1页PCR-SSP检测HLA-B27

一、试验目标

掌握HLA基因分型原理，学习PCR-SSP基因分型方法。二、试验原理

编码HLA基因含有高度多态性，每一个基因座位上有众多复等位基因，而每一个等位基因都有其各自DNA序列，所以可用对应序列特异性引物（sequencespecificprimers，SSP）进行扩增。经过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其对应等位基因，而不扩增其它等位基因。

PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第2页试验步骤

PCR扩增琼脂糖凝胶电泳抽提DNA

PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第3页PCR扩增基本原理①模板DNA变性（热变性）模板DNA双链或经PCR扩增形成双链DNA解离②模板DNA与引物退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；③引物延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新与模板DNA链互补半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，2～3小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第4页PCR扩增体系模版DNA上游引物下游引物dNTP（原料）缓冲体系(各种离子与水)耐热DNA聚合酶PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第5页

PolymorphismintheMHCVariation>1%atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualsEachpolymorphicvariantiscalledanalleleInthehumanpopulation,over1,200MHCalleleshavebeenidentified.MHCgenesarethemostpolymorphicknownPCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第6页Polymorphicresiduesarelocatedintheantigen-bindinggroove—VariationinaminoacidsequenceschangestheshapeofthegroovePCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第7页SchematicdiagramofclassIandclassIIMHCgenes,mRNAtranscripts,andproteinmoleculesPCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第8页EveryHLAallelehasitsownuniquesequencesPCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第9页Specificsequenceprimer(SSP)isdesignedtobindtotheallelicsequencescomplementarily

PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第10页SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRPCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第11页SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRPCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第12页三、试验材料和方法

1、血样：0.2mlEDTA抗凝血

2、红细胞裂解液

3、白细胞裂解液

4、PCR混合液

PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimersPCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第13页HLA-B27检测操作流程一、DNA提取1、取1mlRBC裂解液入血样管中混匀，裂解RBC;2、离心4000rpm2min;3、重复步骤1-2两次，最终用棉签吸干管壁液体；4、取100ulWBC裂解液入上述WBC管中混匀；5、将WBC管于60oC水浴消化20min；6、取出WBC管再于100oC，3-5min，灭活蛋白酶K；7、离心10000rpm2min。上清即为富含DNAPCR模板。PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第14页二、PCR扩增1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液小管中（注意不要加到石蜡油层）；2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min）

×12×23

预变性：

94oC2min

变性：94

oC

12sec

复性：62

℃

1min

延伸：72

℃30sec

变性：94

oC12sec

复性：58

oC50sec

延伸：72

oC

30sec

37

oC10sec

HLA-B27扩增程序PCRSSP检测HLAB专题知识专家讲座第15页三、电泳检测

吸PCR产物10ul加到2%琼脂糖凝胶孔内；将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V