经典液相色谱法

第十一章经典液相色谱法现在是1页\一共有51页\编辑于星期日液相色谱法（LC）：以液体为流动相的色谱法回顾液相色谱柱色谱法平面色谱法纸色谱法薄层色谱法现在是2页\一共有51页\编辑于星期日一、吸附色谱法1.要求：

固定相→吸附剂（硅胶或Al2O3）具表面活性吸附中心2.分离机制：利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附系数注：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质及温度有关

吸附平衡

Xm+nYa→Xa+nYm

第一节基本原理与分类（一）分离原理现在是3页\一共有51页\编辑于星期日一、吸附色谱法3.流动相的洗脱能力:与溶剂极性有关溶剂极性越强，洗脱能力越强→组分ka越小→柱色谱：tR越短→组分越快流出平面色谱：Rf越大→展开越快（展距越长）

4.洗脱顺序

色谱柱一定，Ka大，即极性越强的组分吸附力越强→→→

柱色谱：tR越长→洗脱慢；反之Ka小，极性越弱组分先被洗脱。平面色谱：Rf越小→展开慢；反之Ka小，极性越弱组分展开快。现在是4页\一共有51页\编辑于星期日附：常见化合物极性①见登山图1②双键↑，吸附力↑③分子内氢键，吸附力↓二甲胺酯酮酰胺醛硫醇胺类醇酚羧酸硝基化合物醚烯烃烷烃取代基极性登山图1现在是5页\一共有51页\编辑于星期日附：常见溶剂极性石油醚环已烷四氯化碳苯甲苯乙醚氯仿醋酸乙酯正丁醇丙醇乙醇、甲醇水流动相极性登山图2乙腈现在是6页\一共有51页\编辑于星期日（二）固定相-吸附剂常用吸附剂1.硅胶2.氧化铝3.聚酰胺现在是7页\一共有51页\编辑于星期日1.硅胶（SiO2·xH2O）----极性吸附剂,弱酸性结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键

物质极性↑，吸附能力↑→不易展开，K大，Rf越小

吸附活性次序：束缚型＜游离型

硅醚无活性

2）含水量越大，活性越低，吸附能力越低

加热失水—活化:

105～110OC

(30分钟)----(可逆失水)

200OC------(不可逆失水)→活性丧失适用：分析酸性或中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等选择性保留碱性物质,如胺类硅醚现在是8页\一共有51页\编辑于星期日2.

氧化铝—强极性吸附剂(一般得拖尾峰)

碱性氧化铝pH9～10适于分析碱性、中性物质中性氧化铝pH≈7.5适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH4～5适于分析酸性、中性物质3.聚酰胺

氢键作用氢键能力↑强，组分展开越慢应用：分离酚、酸、硝基、醌类如：黄酮类化合物活化温度:200~400℃(0.5h)应用：分离生物碱、挥发油、萜类、甾体、甙、酯、内酯等现在是9页\一共有51页\编辑于星期日硅胶含水量%氧化铝含水量%活性级别吸附活性(能力)051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ大(强)↓↓↓小(弱)4.吸附剂的活性吸附剂含水量越高，吸附活性越低，吸附能力越弱，活性级数越大，同一组分和流动相，其K越小

加热失水—活化加水—减活或失活分离极性小的组分—选吸附活性大的吸附剂分离极性大的组分—选吸附活性小的吸附剂现在是10页\一共有51页\编辑于星期日1.分离机制

利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离

狭义分配系数二、分配色谱法液液分配色谱（LLC）：K与流动相的性质（极性及种类）有关

气液分配色谱（GLC）：K与固定相极性和柱温有关现在是11页\一共有51页\编辑于星期日1）要求：

固定相—固定液机械涂渍在惰性载体上的液体（易流失）

化学反应键合在载体表面—化学键合相

流动相→必须与固定相不为互溶（LLC）

载体→惰性，性质稳定

不与固定相和流动相发生化学反应2.固定相和流动相2）液液分配色谱的类别：

正相分配色谱→固定相极性大于流动相反相分配色谱→固定相极性小于流动相

正相分配色谱:极性弱的组分先被洗脱反相分配色谱:极性强的组分先被洗脱3)洗脱顺序：极性相似相溶现在是12页\一共有51页\编辑于星期日洗脱顺序极性大的组分，K小→tR短，先出柱

正相液—液分配色谱

反相液—液分配色谱固定相强极性溶剂:水、醇类等弱极性溶剂:辛烷、氯仿等流动相强极性化合物弱极性至非极性物质极性小的组分，K小→tR短，先出柱分离对象弱极性溶剂:苯、甲苯、环己烷等强极性溶剂:缓冲溶液、醇类等现在是13页\一共有51页\编辑于星期日化学键合相：

将固定液的官能团键合在载体的表面，而构成键合相。

以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法。化学键合相既有分配作用又有吸附作用※正相键合相色谱法如氰基与氨基化学键合相流动相用烷烃，加适量极性调整剂而构成※反相化学键合相如十八烷基键合相流动相常用甲醇—水或乙腈—水现在是14页\一共有51页\编辑于星期日三、离子交换色谱法1.分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同选择性系数

注：KA/B越大，A离子交换能力越大，越易保留，tR越长

以阳离子交换树脂为例

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

固定离子可交换离子B待测离子A通式：R-B+A→R-A+B现在是15页\一共有51页\编辑于星期日3.影响保留行为的因素：KA/B与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关

1）离子价态越高→Ka越大→tR越长2）价态相同，水合离子半径越小，Ka越大→tR越长3）交换能力强的离子组成的流动相洗脱能力强→tR越短

4）离子强度大的流动相洗脱能力强→tR越短2.固定相→离子交换剂经典离子交换色谱：离子交换树脂HPLC：化学键合离子交换剂

流动相→水为溶剂的缓冲溶液现在是16页\一共有51页\编辑于星期日四、分子（空间）排阻色谱法要求：

固定相→多孔性凝胶—凝胶色谱

流动相→水——凝胶过滤色谱(GFC)

流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱(GPC)

分离机制：根据被测组分分子大小的不同分离—分子筛原理渗透系数Kp

注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关

Kp=0：尺寸太大全被排阻Kp=1：尺寸太小全被保留0＜Kp＜1现在是17页\一共有51页\编辑于星期日空间排阻色谱法的分类：1、凝胶渗透色谱法GPC：

分离亲脂性物质固定相:亲脂性凝胶如甲基交联葡聚糖凝胶流动相:有机溶剂2、凝胶过滤色谱法GFC：

分离水溶性物质固定相:亲水性凝胶如葡聚糖凝胶流动相:水现在是18页\一共有51页\编辑于星期日分离对象：大分子量（＞2000）的化合物

有机聚合物（如聚烯烃、聚苯乙烯和聚酰胺等）生物大分子（如蛋白质、核酸、低聚糖、肽类等）局限：不能分离大小相近的化合物为得到良好的分离，组分的分子量应相差10%以上。应用Kp∝尺寸∝相对分子质量——可应用于高分子分子量的测定现在是19页\一共有51页\编辑于星期日

结论：四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和渗透系数除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响现在是20页\一共有51页\编辑于星期日第三节平面色谱法分类：平面色谱薄层色谱(TLC)纸色谱（PC）薄层电泳法吸附薄层色谱分配薄层色谱分子排阻薄层色谱P236现在是21页\一共有51页\编辑于星期日一、平面色谱参数（一）定性参数

1、比移值（Rf）Rf=0:组分在原点，完全被固定相保留Rf=1:组分在前沿，完全不被固定相保留

最佳范围：0.3-0.5

可用范围：0.2-0.8LALBL0现在是22页\一共有51页\编辑于星期日讨论1）Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关

2）K↑大，Rf↓小3）薄层板一定，对于极性组分展开剂极性↑大，Rf↑大（容易展开）展开剂极性↓小，Rf↓小（不容易展开）☆色谱条件一定，Rf只与组分性质有关——薄层色谱定性参数☆Rf值与组分性质、薄层板性质、展开剂性质、展开室内展开剂蒸气饱和程度、温度等有关现在是23页\一共有51页\编辑于星期日续前2.相对比移值Rst

讨论参考物与被测组分在完全相同条件下展开

可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分相对比移值Rst与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1现在是24页\一共有51页\编辑于星期日定义式：R=2d/（W1+W2）=2(L2-L1)/（W1+W2）W1,W2：各斑点直径完全分离：R≥1.5基本分离：R＝1.0最佳分离：R=2.0（二）分离度薄层扫描图dW1W2L0现在是25页\一共有51页\编辑于星期日

柱色谱

平面色谱属性定距洗脱定时展开流动相名称保留时间tR

比移值Rf(展开距离)

定性参数洗脱剂展开剂K越小→tR越短洗脱越快展开顺序K越小→Rf越大展开越快现在是26页\一共有51页\编辑于星期日

二、薄层色谱法定义：将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法薄层板：铺好固定相层的板特点：1、分离能力强，斑点集中；2、灵敏度高；3、展开时间短；4、试样预处理简单；5、上样量大；6、仪器简单操作方便现在是27页\一共有51页\编辑于星期日（一）吸附薄层色谱法的吸附剂和展开剂常用吸附剂1.硅胶2.氧化铝3.聚酰胺二、薄层色谱法现在是28页\一共有51页\编辑于星期日（二）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相选择）根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性现在是29页\一共有51页\编辑于星期日吸附剂和流动相的选择：

依据被测组分、吸附剂和流动相的性质1.被测组分性质（极性大小）：

烃＜--------＜羧酸2.吸附剂的活性：

吸附剂的活性↑大，对组分的吸附能力↑强，K↑大

强极性物质——选择弱吸附剂弱极性物质——选择强吸附剂3.流动相的极性：

流动相极性↑大，对组分的展开能力↑大,K↑小

“相似相溶”原则：根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相现在是30页\一共有51页\编辑于星期日4.三者关系图示：

组分吸附剂流动相极性活性小极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性5.展开顺序:

固定相、展开剂一定

极性越小者Rf越大,展开快极性越大者Rf越小,展开慢6.吸附剂活性越大，Rf展开剂极性越大，Rf现在是31页\一共有51页\编辑于星期日例.硅胶板分离生物碱，展开剂为：环己烷:丙酮:乙二胺:水=10：5：2：51）环己烷：弱极性，减弱洗脱能力，增大K，减小Rf2）水：强极性，增强洗脱能力，减小K，增大Rf3）丙酮：中等极性，增加极性与弱极性溶剂间的互溶性4）乙二胺：调节pH值，抑制组分离解，减少斑点拖尾。现在是32页\一共有51页\编辑于星期日（二）薄层色谱操作方法1）薄层板的类型（1）硬板：加粘合剂—湿法铺板（2）软板：无粘合剂—干法铺板

1.薄层板的制备2）粘合薄层板（硬板、湿板）的铺制⑴粘合剂煅石膏：吸附剂的9-15%左右—硅胶-G板羧甲基纤维素钠CMC-Na：0.5-1%水溶液—硅胶-CMC板现在是33页\一共有51页\编辑于星期日3）铺板方法（1）倾注法铺板（2）平铺法铺板（3）机械涂铺法铺板4）活化凉干-活化-放冷-干燥器中注意：活化温度及时间（105℃，1h）活化的目的（除去水分）现在是34页\一共有51页\编辑于星期日2.点样1）样品溶液

避免用水作溶剂，斑点易扩散，溶剂不易挥发一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性溶剂最好用与展开剂极性相似的溶剂2）点样量

几到几十微克，点样直径不超过2~3mm间距1.5~2cm端距1~2cm直径:3mm。几~几十微克，少于10μL起始线现在是35页\一共有51页\编辑于星期日3.展开(1)展开方式:上行展开法、近水平展开双向展开、同向多次展开

软板——近水平展开硬板——上行法(2)展开中注意之点a)边缘效应：同一物质在同一薄板上展开时两边的Rf值与中间部分的Rf值不同b)消除边缘效应的措施：展开前充分饱和15~30min展开槽内壁贴上滤纸条浸湿选小体积展开槽现在是36页\一共有51页\编辑于星期日图示现在是37页\一共有51页\编辑于星期日4.显色显色方法1、有色化合物——直接定位2、无色显色剂：通用有碘、碘化铋钾、溴甲酚绿、硫酸例：分离酸性物质

选酸性硅胶板，使用溴甲酚绿为显色剂紫外吸收紫外灯检出斑点有荧光荧光板上有暗斑显色剂定位喷雾显色蒸气显色：碘-生物碱、氨基酸衍生物、肽类、脂类及皂苷喷雾后加热显色★现在是38页\一共有51页\编辑于星期日1）Rf定性（三）定性与定量分析1.定性分析⑴组分的结构和性质⑵薄层板的性质⑶展开剂的性质⑷温度（对分配影响大，对吸附影响小）⑸展开室内展开剂蒸气饱和程度影响比移值的因素2）相对比移值Rst定性与对照品Rst比较或与文献Rst比较。现在是39页\一共有51页\编辑于星期日2.杂质检查1）杂质对照品比较法：同一色谱条件下比较试样与杂质对照品斑点的颜色深浅2）主成分自身对照法

供试品

稀释对照液→对照斑点颜色

硫酸长春碱稀释对照液→展开→紫外检测10mg/ml0.20mg/ml254nm现在是40页\一共有51页\编辑于星期日3.定量分析1）洗脱法定量：薄层分离——取下斑点——洗脱——离心——取上清液进行测定2）原位直接定量——薄层扫描法

现在是41页\一共有51页\编辑于星期日1）薄层扫描法原理----样品经TLC分离,按光学原理(吸收光、反射光、荧光等）进行定量分析检测原理荧光法透射法反射法反射法测定：重现性好，基线稳定。薄层扫描法定义：用一定波长、强度的光束照射薄层上的斑点，测量照射前后光束强度的变化来测定物质含量现在是42页\一共有51页\编辑于星期日2）光谱扫描曲线：A-或F-ex-em用途：对斑点成分作定性分析为定量分析找出测量sSA现在是43页\一共有51页\编辑于星期日3）色谱扫描曲线在一定的波长下，可找出斑点的位置，即A-L(Rf)的关系起始线LA（1）单波长（s）扫描法（2）双波长（R，

s）扫描法：得△A，可消除本底干扰，基线稳定4）扫描方式：直线式：快。用于规则的圆斑锯齿式：慢。用于不规则的或规则的斑点定量定性分析及荧光定量分析一律用直线式测定波长λs及参比波长λR的选择λs：被测组分的最大吸收波长λR：不被被测组分所吸收的波长—薄层板的空白吸收现在是44页\一共有51页\编辑于星期日练习例1.硅胶柱分离羧酸，哪种溶剂tR最小（）A.苯B.乙酸乙酯C.乙醇D.丙酮E.丙醇例2.硅胶板以丙酮为展开剂，下列化合物中哪种Rf最大（）；哪种Rf最小（）A.芳烃B.羧酸C.酯D.胺E.酮答案：CAB现在是45页\一共有51页\编辑于星期日例3.正相液液色谱柱上分离一极性化合物，哪种溶剂使其tR最小（）A.苯B.石油醚C.乙醇D.甲醇E.丙醇例6.反相液液色谱柱上分离一非极性化合物，哪种溶剂使其tR最小（）A.苯B.