实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座

主讲人：王文锋E－mail：wwf5718@163.com质粒DNA电泳检测实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第1页一、试验目标1.掌握利用溴化乙锭（EB）在紫外下检测DNA原理。2.掌握水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA方法、步骤。3.掌握在紫外灯下判断DNA浓度、分子量大小、纯度等方法。

实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第2页二、试验原理

依据分离DNA大小及类型不一样，DNA电泳主要分两类：聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳

实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第3页

DNA电泳影响原因（1）DNA分子大小

DNA分子越大在胶中摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量对数值成反比。（2）DNA分子构型超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。（3）不一样胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。

实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第4页（4）电场强度电场强度偏高时电泳分离线性范围会变窄，电压过高时也会因为电泳中产生大量热量造成DNA片段降解。（5）电泳缓冲液当前有3种缓冲液适合用于天然双链DNA电泳：TAE、TBE和TPE。

（6）溴化乙锭简称EB，电泳中染色剂，含有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间.实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第5页DNA电泳上样缓冲液主要作用以下：预防电泳过程中DNA被降解，普通上样缓冲液中含10mmol/lEDTA。增加样品密度以确保DNA沉入加样孔内，普通上样缓冲液中加入一定浓度甘油或蔗糖，增加样品比重。指示剂监测电泳行进过程。实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第6页三、操作步骤1．称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml恰好倒两块小胶。2．注意观察烧瓶中琼脂糖粉末，待完全熔化后停顿微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。3．戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50～60C）。实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第7页4．把梳子插到凝胶灌制模具正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10～20min待胶完全凝固。（剩下胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。5．在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。依据电泳槽长度把电泳仪电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极位置连接正确。实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第8页6．待胶完全凝固后（15～20min），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔一侧要朝向电泳槽负极。7．剪1片光面纸（或封口膜），点6l蒸馏水、1l10加样缓冲液，再加入3l质粒DNA溶液制成10lDNA样品。实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第9页8．在凝胶上选择相邻加样孔。用10l吸液头分别将管中样品加入凝胶加样孔中（假如需要时，在相邻加样孔中加入1.5～3lDNA分子量标准物）。看到蓝色样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶底部）缓缓将蓝色样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第10页9．打开电源开关，样品将形成一条蓝色横带向前移动（假如发觉蓝色向后移动，马上关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。10．当蓝色溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第11页11．把凝胶小心反扣放入盛有EB搪瓷盒中。放置约10min后，取出用自来冲洗两次。放入凝胶成像系统中拍照。12．清理垃圾。染有EB凝胶要放到专用垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。13．撰写试验汇报。实验七质粒DNA的电泳检测专家讲座第12页四、作业1.泳道中质粒DNA有几条带