生物化学与分子生物学课件 基因工程cbm1312

2023/4/24sxmu-biochem-CBM1重组DNA技术RecombinantDNAtechnology第二十一章2023/4/24sxmu-biochem-CBM22023/4/24sxmu-biochem-CBM32023/4/24sxmu-biochem-CBM41997年12月，英国Roslin研究所克隆羊多利（Dolly）的诞生揭示一个全新概念：由成年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同的新生命个体。2023/4/24sxmu-biochem-CBM5

基因工程技术的神奇所在？

胰岛素的提取：100000胰脏只能提取3～4克，而用“工程菌”进行发酵生产，则只要几升发酵液就可取得同样数量的产品。1982年美国EliLilly公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。

2023/4/24sxmu-biochem-CBM62023/4/24sxmu-biochem-CBM7重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉2023/4/24sxmu-biochem-CBM8遗传学之父孟德尔（1822－1884）2023/4/24sxmu-biochem-CBM9重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉2023/4/24sxmu-biochem-CBM101944年代科学家Avery发现从一种具有夹膜、致病性的肺炎球菌中提取的核酸，可使另一种无夹膜、不具致病性的球菌的遗传性状发生改变，变成有夹膜和致病性的肺炎球菌，其中的奥秘不言而喻，核酸将携带有夹膜和致病性等的遗传信息传至另一种球菌中，因此，核酸是遗传信息的载体，也是遗传的物质基础。2023/4/24sxmu-biochem-CBM11重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉.2023/4/24sxmu-biochem-CBM12

现代基因工程的创始人P·Berg（美国,1926－）1972年，Berg把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。

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1973年，美国斯坦福大学教授S·Cohen和加州大学旧金山分校教授H·W·Boyer将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。2023/4/24sxmu-biochem-CBM14

Cohen随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。

1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。

2023/4/24sxmu-biochem-CBM15重组DNA技术的意义

●跨越生物种属间不可逾越鸿沟●使人能对生物进行定向改造●可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制,从而拓宽了分子生物学的研究领域。

2023/4/24sxmu-biochem-CBM16相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理（基本过程）重组DNA技术与医学的关系本章主要内容2023/4/24sxmu-biochem-CBM17一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆相关概念

2023/4/24sxmu-biochem-CBM18技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

细胞克隆个体克隆（动物或植物）2023/4/24sxmu-biochem-CBM19DNA克隆的基本定义应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。2023/4/24sxmu-biochem-CBM20DNA克隆的基本定义：除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术（DNAecombination）分子克隆（Molecularcloning）基因克隆（Genecloning）2023/4/24sxmu-biochem-CBM21基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质（原理）结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，产生人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组2023/4/24sxmu-biochem-CBM22生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。2023/4/24sxmu-biochem-CBM23（二）工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶2023/4/24sxmu-biochem-CBM24重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基2023/4/24sxmu-biochem-CBM25限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ2023/4/24sxmu-biochem-CBM26作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）2023/4/24sxmu-biochem-CBM27第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶2023/4/24sxmu-biochem-CBM28Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG2023/4/24sxmu-biochem-CBM29BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口2023/4/24sxmu-biochem-CBM30同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ2023/4/24sxmu-biochem-CBM31同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA2023/4/24sxmu-biochem-CBM32（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)2023/4/24sxmu-biochem-CBM33（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA2023/4/24sxmu-biochem-CBM34克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。2023/4/24sxmu-biochem-CBM35载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。2023/4/24sxmu-biochem-CBM361.质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM382023/4/24sxmu-biochem-CBM39λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列2023/4/24sxmu-biochem-CBM403.粘性质粒(cosmid)2023/4/24sxmu-biochem-CBM41酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他2023/4/24sxmu-biochem-CBM42二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

2023/4/24sxmu-biochem-CBM43基因克隆示意图

以质粒为载体的DNA

克隆过程目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM45（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

2023/4/24sxmu-biochem-CBM46*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM50引物引物3’5’5’5’PCR技术基因组2023/4/24sxmu-biochem-CBM51（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM542.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM563.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM584.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM60受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌2023/4/24sxmu-biochem-CBM61◆转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.◆转染(transfection):

以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程.2023/4/24sxmu-biochem-CBM62感染(infection):以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子,经体外包装成具有感染性噬菌体或病毒颗粒后,借助于噬菌体或病毒的蛋白外壳将重组DNA分子注入细菌或真菌细胞,从而使目的基因得以复制的过程.2023/4/24sxmu-biochem-CBM63（五）重组体的筛选

1.直接选择法(1)

抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹

2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等(插入失活法)抗药性标记选择目录组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM66α－互补（蓝白菌落筛选或称x－gal筛选，本节难点）α互补的检测目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM68原位杂交目录Southern印迹目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM71重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因选限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM73表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达2023/4/24sxmu-biochem-CBM741.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表达体系的不足

不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

很难表达大量可溶性蛋白2023/4/24sxmu-biochem-CBM75优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA

真核细胞具有翻译后加工系统，可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，使表达蛋白形成正确的天然构象，具有完整的生物学活性。某些真核细胞可将外源基因表达产物直接分泌至细胞培养基中，简化了分离纯化的操作。缺点：操作技术难、费时、不经济2.真核表达体系

酵母、昆虫、乳类动物细胞2023/4/24sxmu-biochem-CBM76转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射

2.真核表达体系

酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达载体pFASTBACI的物理图谱目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM78（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系（二）生物制药

重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱目录2023/4/24sxmu-biochem-CBM80

正在开发的350种生物技术药物中，1/3以上用于肿瘤，其中有30种用于黑素瘤，20种用于结直肠癌，13种用于乳腺癌，13种用于前列腺癌。正在开发的疫苗有77种，用于预防或治疗HIV感染、AIDS、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、多发性硬化、中风。正在开发的生物技术药物中，有29种用于HIV感染、AIDS和AIDS相关疾病；19种用于自身免疫性疾病，其中11种用于类风湿性关节炎、3种用于狼疮；8种用于血液疾病，其中4种用于血友病，一种用于镰形细胞性贫血。

2023/4/24sxmu-biochem-CBM81基因工程用于疫苗生产常用的制备疫苗的方法，一种是弱毒活疫苗，一种是死疫苗。两种疫苗各有自身的弱点。活疫苗隐含着感染的危险性。死疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接种。利用基因工程制备重组亚基疫苗，可以克服上述缺点，亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含病原物遗传信息。重组亚基疫苗就是用基因工程方法，把编码抗原蛋白质的基因重组到载体上去，再送入细菌细胞或其他细胞中区大量生产。这样得到的亚基疫苗往往效价很高，但决无感染毒性等危险。

在酵母中表达乙型肝炎表面抗原HBsAg产量可达每升2.5mg，已于1984年问世。基因工程生产疫苗有良好的发展前景。2023/4/24sxmu-biochem-CBM82基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断基本过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断2023/4/24sxmu-biochem-CBM83

基因治疗，即是通过基因水平的操作来治疗疾病的方法。目前的基因疗法是先从患者身上取出一些细胞（如