单纯TACE或TACE联合其他治疗方法

单纯TACE或TACE联合其他治疗方法:一项肝癌动物模型的对比研究摘要本研究目的是比较单纯TACE和TACE联合其他治疗方法在肝癌动物模型的效果。50只雄性ACI大鼠被膜下种植实体3924A肝癌（0天），第13天采用MRI测量肿瘤体积（VI）。第14天开腹后将导管逆行插入胃十二指肠动脉，根据实验计划进行下列介入操作：TACE（MMC+B化油）+免疫治疗（A组TNFa+IL-2；B组OK-432+IL-2）；TACE+抗血管生成治疗（C组TNP-470;D组内皮抑素）；E组单纯TACE对照组）。采用MRI计算肿瘤体积（V2）,并计算比率X（V2/V1）。统计分析显示B组（X=6.53）和C组（X=4.01）其肿瘤生长与对照组比较有显著性差异（尸＜0.05）,C组与其他治疗组比较有显著差异（尸＜0.05）。TACE联合免疫治疗（OK-432）和抗血管生成治疗（TNP-470）比单纯TACE治疗在肝癌动物模型治疗中能有效抑制肿瘤生长。关键词肝，肝细胞癌；TACE前言肝细胞癌（HCC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年约死亡100万人。由于快速浸润生长和合并肝硬化，预后很差。直到今天，外科治疗包括手术切除和肝脏移植仍被认为是可能治愈肝癌的方法，尤其是对病灶小河没有浸润转移的病例。然而，由于病灶多中心生长、肝外转移、早期血管浸润、缺乏捐献器官、并发症和合并症发生率高，只有少数病人适合外科手术。肿瘤局部消融治疗，包括肝动脉栓塞化疗术（TACE）、经皮穿刺酒精注射术（PEI）、射频消融术（RFA）、微波固化治疗（MCT）、激光热疗（LITT），是常用的辅助治疗，特别是对肝功能下降、不能手术切除或多发的病灶。TACE被认为是对于不能手术切除的HCC病人的一种姑息治疗，现在已成为一种最常用的介入治疗方法，TACE已被证明可以减轻系统毒性，增加局部效果，增强治疗效果。当肿瘤已浸润或乏血供时，TACE由于缺乏合适的栓塞剂而影响其治疗效果。最近几年，局部免疫治疗和抗血管生成治疗对于治疗不能手术切除的HCC患者已显示出令人鼓舞的效果，特别是对于肝内转移和HCC复发的患者。这样TACE联合辅助治疗可能会增强TACE的治疗效果。然而，至今关于这些联合治疗的动物实验的随机研究很少报道。本研究的目的是在HCC动物模型中比较单纯TACE和TACE联合其他疗法的效果。材料和方法动物模型瘤株为Morris肝癌细胞3924A，一种生长快、低分化的肝细胞肝癌，种植到ACI大鼠，肿瘤组织取自德国癌症研究中心。50只雄性ACI大鼠，重220~260克，饲养条件为传统条件，温度22±2°C，相对湿度55±10%，标准实验条件饲养，所有动物实验均符合德国政府和动物研究的规定。药物局部免疫药物TNFa已知是一种具有多种生物活性的主要的炎症介质和主要的细胞素级联的起始因子，临床应用主要是作为I期抗肿瘤药物，但已被证实效果欠佳。用前20分钟将7.5pgTNFa溶于0.5ml0.9%NaCl溶液中备用。OK-432是一种抗肿瘤药，由日本东京Chugai医药公司提供。用前20分钟将0.05mgOK-432溶于0.5ml0.9%NaCl溶液中备用。IL-2已知是一种有效的免疫药物，可有效抗癌。用前20分钟将5X103IUIL-2溶于0.5ml0.9%NaCl溶液中备用。抗血管生成药物内皮抑素是一种XVIII分裂产物，在大鼠中可以知肿瘤血管生成和生长。用前10分钟将0.8mg内皮抑素溶于0.5ml0.9%NaCl溶液中加0.05ml酒精备用。TNP-470(AGM-1470)是一种合成的烟曲霉素类似物，可选择性抑制内膜增殖，从而起到抗肿瘤效果。用前10分钟将5mgTNP-470溶于1ml枸橼酸磷酸盐缓冲液中（pH6.2）备用。麻醉在所有介入操作和影像检查时，动物采用腹腔内注射盐酸氯胺酮100mg/kg或盐酸甲苯噻嗪15mg/kg麻醉。肿瘤种植（0天）肿瘤种植方法基本同Yang等报道一致，稍作修改。将Morris3924A皮下种植（含5X106肿瘤细胞）后2周，切成2mm3块。麻醉下在ACI大鼠肝左叶包膜下切一小口，将肿瘤组织块植入肝内，然后关腹。介入治疗（14天）采用PE-10聚乙烯导管（内径0.28mm，外径0.61mm）在剖腹下插管。采用双筒手术显微镜，导管逆行插入胃十二指肠动脉，然后前推进入肝总动脉，由于肝动脉分支细小不能做超选择性插管栓塞。采用对手压肝右动脉以保证药物直接流入肝左动脉。采用三明治栓塞技术（顺序注入MMC-生物治疗-碘化油）在20分钟内经导管注入药物进入肝动脉，注射中导管位置应在肝动脉内以做到中心性栓塞，防止药物返流进肝总动脉和腹腔干。50只大鼠随机分成5组（A-E）,每组10只，所有的动物都接受TACE治疗：MMC0.1mg,碘化油0.1ml。在A组和B组，经动脉免疫治疗联合应用TNFa+IL-2（A组）和OK-432+IL-2（B组）；抗血管生成治疗是联合应用TNP-470（C组）和内皮抑素（D组）；E组10只大鼠单纯TACE治疗。MRI扫描（13天；27天）和分析对比不同的HCC影像学检查方法，我们决定应用MRI扫描。所有的检查使用1.5TSonata超导系统，使用腕部线圈于治疗前（13天）和治疗后（28天）作MRI扫描T1加权（SE:TR/TE,460/15ms）和T2加权（TSE:TR/TE,3170/99ms）,横断面扫描厚度2mm，184X256矩阵。MRI扫描图像由两名放射科医生分析肿瘤大小、坏死和肝内、外转移，层间无间隔，未作强化扫描。肿瘤体积由T2加权图像根据下述公式计算：肿瘤体积=最大径（mm）X[最小径（mm）]2/2.统计分析采用SAS软件，比较治疗组与对照组肿瘤生长率采用Dunnett’s分析，比较治疗组间的差异采用Student-Neuman-Keuls分析，显著水平为0.05。结果肿瘤种植肿瘤种植成功率为100%，在肿瘤种植和介入治疗期间无大鼠死亡。治疗前MRI平扫发现50只大鼠中有50个病灶（100%），介入治疗后50只大鼠有50个病灶生长（100%）。MRI扫描和分析由于采用2mm层厚计算小的病灶的体积，现在的成像技术受到限制，病灶与周围肝组织间的界限由放射科专家根据不同的信号强度判定。V2/V1的平均比率在A组为7.30，B组6.53，C组4.01，D组7.78，E组为9.14。与对照组E组（单纯组）比较，B组（TACE+OK-432+IL-2）和C组（TACE+TNP-470）有显著减小（P<0.05）,而A组（TACE+TNFa+工-2）和D组（TACE+内皮抑素）无显著差异（P>0.05）。C组与其他治疗组间比较有显著差异（P<0.05）。A组10只大鼠中有1只，E组10只中有2只发生肝内转移。在T2加权图像中可能代表肿瘤内坏死区，在A、B、D和E组中有1只，在C组中有2只。讨论自从TACE作为一种姑息性治疗方法用于治疗不能手术切除的HCC以来，TACE已成为一种最常用的介入治疗方法。TACE应用碘化油已显示可使HCC缩小，减轻系统毒性从而提高治疗效果。然而它也存在着是否能延长患者总的生存率的问题。已知提高肝癌总的治疗效果依靠综合治疗，然而对于TACE联合生物治疗的实验研究或临床报道较少，所以我们设计了该项研究，观察TACE联合局部免疫治疗和抗血管生成治疗与单纯TACE治疗在Morris3924A大鼠动物模型中的价值。该动物模型与人类肝细胞癌类似，优于Walker-256和VX-2动物模型。OK-432可以增强丝裂霉素（MMC）的抗肿瘤效果，因为OK-432本身就具有细胞毒性，可以抑制肿瘤细胞的生长活性。化疗可以增强肿瘤细胞对细胞毒性效应细胞的敏感性，包括淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，被OK-432激活通过直接损害或通过化疗调节表面抗原。而且，丝裂霉素能消除血液或渗出液中的抑制细胞或抑制因子，强化OK-432激活的免疫增强细胞，特别是T细胞的抗肿瘤活性，这也被经动脉免疫栓塞（TIE）的组织学检查，结果比传统的TAE治疗人类的包膜外浸润和阻止肝内转移的效果更有效所证实。Okuno等发现肝动脉灌注IL-2能增强肝动脉内皮的渗透性，结果可增强抗肿瘤药物的渗透，此现象可以增加抗肿瘤药物释放进入肝脏，所以可以减少与药物有关的系统毒性。我们的免疫化疗栓塞方法就是基于上述的研究结果表明的TIE的价值和局部的免疫化疗。结果表明，OK-432联合TACE比单纯TACE可明显降低肿瘤的生长率，无肝内转移发生。在本实验中，OK-432显示出在TACE中的有效的抗肿瘤效果。TNFa，另一种生物反应修饰因子，在体外具有多种生物活性，例如对癌细胞的毒性、损害内皮细胞和增强成纤维细胞的增殖。Watanabe等发现在兔动脉内灌注TNFa/碘油乳剂能产生显著的抗肿瘤效果，可能是由于TNFa在肿瘤中集聚和滞留，引起肿瘤血管内皮的损伤。在Yang等的实验性研究中，连续ACI大鼠肝动脉灌注TNFa联合肝动脉结扎术，能明显阻止肿瘤的生长。注意将导管留在肝动脉中，在后期可将其作为肿瘤栓塞的中心。我们研究设计受到长期留置在肝动脉内的导管的限制，由于此原因，与Yang等研究相比只有少量的TNFa联合IL-2经动脉注射到肝脏肿瘤当中，这可以解释为什么TNFa联合TACE治疗不能明显降低肿瘤的生长。抑制血管生成药物因选择性作用于肿瘤的血管系统，所以具有较低的毒性，它们联合抗癌药物能增强其抗癌效果。为获得最佳临床效果，抗血管生成治疗应联合其他辅助治疗。TNP-470抑制内皮细胞增殖和迁移，抑制毛细血管网形成。研究表明TACE治疗引起的缺血缺氧和坏死能刺激存活的HCC血管形成。动物实验表明，联合应用TNP-470能增加某些细胞毒性和生物活性药物的抗癌效果，但在血浆中的半衰期很短，一般注射后1h就从血循环中清除。据报道TACE联合TNP-470能增强TACE治疗HCC的效果，而对肝脏无严重副作用。我们的结果表明，TACE联合动脉内应用TNP-470与单纯TACE比较，能显著降低肿瘤的生长率（P<0.05）,它的抗肿瘤效果优于免疫治疗组（TACE+OK-432和TACE+TNFa）。本研究应用的内皮抑素是一种新的抗血管生成因子。体外研究表明内辟一素可以抑制VEGF引起的内皮细胞迁移，体内研究表明具有抗肿瘤活性，而无任何的毒性。研究显示内皮抑素能抑制裸鼠的HCC的生长（52.2%）。内皮抑素联合传统化疗能增强鼠结直肠癌早期肝转移模型的治疗效果。我们的结果表明，选择性应用内皮抑素联合TACE与单纯TACE比较，未显示出抑制肿瘤生长的优势，且发生了肝内转移（10%），我们猜想可能是该组研究中枸橼酸磷酸盐缓冲液量过大（1.0ml,只有0.8mg的内皮抑素可溶解），结果大量的MMC和碘化油被冲走，所以抗肿瘤效果被削弱。总之