抗肿瘤药物筛选专家讲座

内容提要一细胞筛选二微生物学筛选方法三精原细胞法四利用分子靶点筛选五动物模型六基因芯片技术抗肿瘤药物筛选专家讲座第1页一细胞筛选抗肿瘤药物筛选专家讲座第2页筛选方法1.四氮唑蓝（MTT）还原法原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功效。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值抗肿瘤药物筛选专家讲座第3页

试验组光吸收值（A）细胞存活率=×100%对照组光吸收值（A）可用细胞存活率对剂量作图求出IC50值抗肿瘤药物筛选专家讲座第4页应用：生物活性因子活性检测、大规模抗肿瘤药品筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。特点：灵敏度高、经济。

缺点：产物不溶于水，需被溶解后才能检测。抗肿瘤药物筛选专家讲座第5页步骤：（1）制备单细胞悬液；(2)对细胞计数后接种于96孔板，普通5000个/孔（可先做细胞倍增试验确定每孔中最正确细胞数）；（3）将培养板放入CO2培养箱，过夜培养；（4）24h后更换培养基，并在每孔细胞中加入不一样浓度药品，继续培养；（5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培养3-6h,停顿培养，弃取培养基,加入DMSO，每孔150ul，轻微震荡混匀；（6）把96孔板放入酶标仪中，490nm测定吸光度。注意：设好对照抗肿瘤药物筛选专家讲座第6页抗肿瘤药物筛选专家讲座第7页抗肿瘤药物筛选专家讲座第8页CCK-8法抗肿瘤药物筛选专家讲座第9页2.集落形成法：注意：适合贴壁细胞，细胞要分散均匀，操作要柔和。3.台盼蓝排斥试验特点：悬浮细胞较方便，贴壁细胞要进行消化，此步误差大。抗肿瘤药物筛选专家讲座第10页二微生物学筛选方法(抗肿瘤抗生素)1.噬菌体法2.细菌变种法3.抗代谢法抗肿瘤药物筛选专家讲座第11页1.噬菌体法噬菌体：是一类能感染微生物病毒抗肿瘤药物筛选专家讲座第12页（1）抗噬菌体法：干扰DNA代谢抗生素如放线菌素、博来霉素常能抑制噬菌体在细菌细胞内生长，从而不产生噬菌体颗粒而出现抗噬菌体现象。（2）溶原性菌诱导法：除烈性噬菌体外，还有一个噬菌体，其基因组直接螯合到细菌染色体DNA，不复制，因其大部分基因功效受到了“阻遏物”阻抑，这种带前噬菌体菌株称温和性或溶原性菌。不过当“阻遏物”量因为细胞内或环境因子（物理、化学）而降低时，溶原性就不能维持，前噬菌体开始生长，是细菌裂解，称为诱导作用。一些抗肿瘤抗生素有诱导能力。抗肿瘤药物筛选专家讲座第13页2.细菌变种法(1)人工培育变种

如:使细菌模仿肿瘤细胞一些代谢特点使细菌对核酸或蛋白合成抑制剂敏感(2)检测突变作用如:依赖链霉素菌株抗肿瘤药物筛选专家讲座第14页3.抗代谢法

抗代谢物在无机氮源合成培养基中显示抗菌作用，而在普通有机氮源营养培养基中无抗菌作用（因为有机氮源可将含有抗菌作用物质代谢），利用此特点，选择无机氮源试验有抗菌作用物质，作为抗代谢初筛方法。抗肿瘤药物筛选专家讲座第15页三精原细胞法(抗生素和植物药)1.建立依据B型精原细胞含有高度敏感性2.试验方法及判定22－28g雄性小鼠，药品直接注入睾丸，不一样浓度，每一浓度用2－3只，注射3天，处死动物，睾丸固定，石蜡包埋切片，苏木精－伊红染色，显微镜观察。抗肿瘤药物筛选专家讲座第16页四利用分子靶点筛选1.抑制血管生成筛选模型体外：血管内皮细胞培养体内：动物眼角膜囊地鼠颊囊裸鼠外耳皮下鸡胚绒毛尿囊膜抗肿瘤药物筛选专家讲座第17页鸡胚绒毛尿囊膜模型鸡胚生物学结构尿囊卵黄囊抗肿瘤药物筛选专家讲座第18页抗肿瘤药物筛选专家讲座第19页对照组低浓度药品试验组中浓度药品试验组高浓度药品试验组抗肿瘤药物筛选专家讲座第20页抗肿瘤药物筛选专家讲座第21页操作步骤：（1）于试验前72h孵育受精蛋（2）试验进行前以照蛋箱透照孵育种蛋，凡已正常发育种蛋可照见胚胎影子，用铅笔做记号，弃取未发育种蛋（3）用碘酒、酒精消毒蛋壳。敲碎蛋壳把鸡胚移入平皿中，加入EagleFs培养液5-10ml，然后，可选择在鸡胚尿囊膜血管网任何位置放置小块明胶海绵作为筛选抗血管生成药品载体，然后加入不一样浓度血管生成抑制剂。（4）于加药后24h、48h和72h分别在显微镜下观察药品作用结果，并摄影。（5）血管计数。可结合自动图像分析系统、摄像等技术完成血管生成抑制率＝（对照组血管面积－药品组血管面积）/对照组血管面积×100％抗肿瘤药物筛选专家讲座第22页2.以端粒酶为靶点药品筛选端粒：真核细胞染色体末端特殊结构。维持染色体稳定性。“生命时钟”“有丝分裂计数器”端粒酶功效：经过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体DNA端粒长度。端粒酶活性测定方法端粒酶抑制剂抗肿瘤药物筛选专家讲座第23页3.细胞凋亡通路靶点

抗肿瘤药物筛选专家讲座第24页细胞周期调控靶点与侵袭相关靶点耐药相关分子靶点靶点选择标准：特异性、有效性、综合性、个性化抗肿瘤药物筛选专家讲座第25页五动物模型整体动物试验法是评价一个药品是否有效最主要方法整体动物在肿瘤药理学研究中作用：1.研究新开发药品对肿瘤防治作用；2.抗肿瘤药品筛选及抗肿瘤机理探索；3.探索药品和当前常规肿瘤治疗方法综合应用以提升疗效。抗肿瘤药物筛选专家讲座第26页

惯用宿主动物：裸小鼠（“活试管”）特点：先天无毛，无胸腺，T淋巴细胞功效完全缺失，对异种移植不产生排斥反应。缺点：费用高，喂养条件高，不宜大量繁殖。普通不用于初筛。应用：观察药品对癌细胞逆转作用，抑制增殖及诱导凋亡作用。抗肿瘤药物筛选专家讲座第27页C57BL/6小鼠特点：黑毛，体型小，性情温顺，易喂养，药敏性好，为研究Lewis肺癌首选。

应用：药品体内初筛。抗肿瘤药物筛选专家讲座第28页模型建立方法实体瘤建立1.小块瘤体接种法2.肿瘤细胞悬液接种法3.培养细胞移植法治疗方案：接种后生长至可触及即可治疗，依药品特征及研究目确实定方案，可给药一次，或连续几次，或一周几次连续几周。疗效评价：肿瘤抑制率＝（对照组瘤重－给药组瘤重）/对照组瘤重×100％抗肿瘤药物筛选专家讲座第29页腹水瘤建立及评价：评价：对照组通常2-3周内死亡，治疗组普通观察50d左右，计算生命延长率。生命延长率＝（治疗组平均存活天数－对照组平均存活天数）/对照组平均存活天数×100％注意事项：1.取材时取实质部位，不要取坏死、液化部位，预防污染。2.试验前先喂养裸鼠一周，以适应新环境，若死亡超出10%不可用，普通18-22g，4-6周龄。3.喂养环境及鼠笼、垫料、饲料严格消毒4.保持恒温，普通25±1℃，湿度40-60%，天天10h光照、14h黑暗。抗肿瘤药物筛选专家讲座第30aysTumorValume(mm3)ACabcdBab抗肿瘤药物筛选专家讲座第31页六基因芯片技术1.原理是一个建立在杂交测序基本理论上全新技术，它利用固定在芯片上几万至几十万条探针与样品进行杂交，在一步试验中获取大量信息。抗肿瘤药物筛选专家讲座第32页2.基本技术路线①基因选择与试验设计

依据表示谱数据库选择5000-10000个与发育及疾病相关基因，制备药品筛选芯片。②芯片制备抗肿瘤药物筛选专家讲座第33页③细胞培养与药品刺激

依据目标药品及表示谱芯片数据库中细胞表示谱选择适当细胞系，用适当计量药品加入细胞培养液中，不一样时间取样，抽提刺激前后mRNA。④大白鼠喂养与药品刺激

用常规方法喂养大白