生物学信息分析

生物学信息分析第1页，共81页，2023年，2月20日，星期六实验目的了解相关的生物信息学数据库（NCBI数据库等）和掌握数据库检索方法，学会相关软件的使用，并利用生物信息学软件根据研究目的和对象设计引物。第2页，共81页，2023年，2月20日，星期六方法根据酶或基因的名称（GenBank登录号）找到需要的基因的核苷酸序列，根据序列和PCR的目的设计获得该基因的CDS的引物(注意引物设计时引物酶切位点)。

第3页，共81页，2023年，2月20日，星期六目的基因序列的检索第4页，共81页，2023年，2月20日，星期六主要数据库介绍GenebankEMBLDDBJ

第5页，共81页，2023年，2月20日，星期六Genebank

Genebank库包含了所有已知的核酸序列和蛋白质序列，以及与它们相关的文献著作和生物学注释。它是由美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立和维护的。NCBI的网址是：第6页，共81页，2023年，2月20日，星期六EMBL核酸序列数据库

由欧洲生物信息学研究所(EBI)维护的核酸序列数据构成，查询检索可以通过通过因特网上的序列提取系统(SRS)服务完成。数据库网址是：http://www.ebi.ac.uk/embl/

第7页，共81页，2023年，2月20日，星期六DDBJ数据库

日本DNA数据仓库(DDBJ)也是一个全面的核酸序列数据库，与Genbank和EMBL核酸库合作交换数据。使用其主页上提供的SRS工具进行数据检索和序列分析。DDBJ的网址是：http://www.ddbj.nig.ac.jp/第8页，共81页，2023年，2月20日，星期六NCBI介绍：NCBI建立在1988年,作为一种公共分子生物学信息资源,而创建的公开数据库。NCBI的计划：1.基本研究；2.数据库；3.软件的开发；4.教育和训练第9页，共81页，2023年，2月20日，星期六现在我们以查找甘薯异戊烯氯喹异构酶（Ipomoeabatatasisopentenyldiphosphateisomerase，ipi）的编码序列为例，介绍如何从ＮＣＢＩ中在线获取所需要的核酸序列．应用举例第10页，共81页，2023年，2月20日，星期六1.进入第11页，共81页，2023年，2月20日，星期六2.选择数据库3.查询关键词4.开始查询第12页，共81页，2023年，2月20日，星期六显示格式符合条件的记录数每页显示数目第13页，共81页，2023年，2月20日，星期六相关记录点击进入第14页，共81页，2023年，2月20日，星期六Genbank格式的序列记录第15页，共81页，2023年，2月20日，星期六第16页，共81页，2023年，2月20日，星期六FASTA格式的序列记录第17页，共81页，2023年，2月20日，星期六基因表达的

ORF分析第18页，共81页，2023年，2月20日，星期六

aagcaagacgccaagggccaaggctggctgcaagaagcaaagaggaacgaacactgtgaa61tatcccaatgtcgatgatggcttctgttcaaatctgtcggagattctctcccctagtcgc121ccggccggcgatttactctgccaattcttcattcctctcaccagtctctttcgcctcttc181ttctctttcaattatgccgatccgcctccgctgcagagcttcagtacactctgtccgcgc241cgcctccaccatgggggacaccatcactgatgccaacatggatgctgtccagcgccgcct301catgtttgacgacgagtgtattttggtggatgagaatgaccgtgttgttggtcatgatac361caagtataattgtcatcttatggagaagattgaatctgagaatctgcttcacagagcttt421cagtgttttcttatttaattcaaactatgagttgcttcttcagcaacgatctgcgacaaa481ggtcaccttccctttggtgtggactaacacctgctgcagccatcctctgtaccgggagtc541tgagttgattgaagagaatgctcttggtgtgaggaatgctgcacaaagaaagcttcttga601tgaactggggattcctgcagaggatgtcccagttgatgaattcacaacattgggccgtat661cctgtataaagcaccttctgatgggagatggggagagcatgaacttgattatcttctctt721cattgtgagggatgttggcatgcacccaaacccggatgaggttgcagatgttaaatatgt781gaatagggaacagctgaaagagatcttgaggaaagcaaatgctggagaggatggtataaa841gctttccccttggttcagattagtcgtcgaaaatttcttgttcaaatggtgggatcatgt901cgagaaaggcaccctaatggaagctgcagatatgaaaaccattcacaagttggcctaaac961agccattggctgagcttttgttaaacccttacatctaccattcacttaactgagcaaaaa1021tatattctatggtcttctgcttagtttcatgcttcatgcttgaactttcaagttttatgt1081tacttttggctgttaggaactagtaatatatgtgaacttgctatcaaaaaaaaaaaaaaa1141aaaaaaaaaaaaaaa//第19页，共81页，2023年，2月20日，星期六基因表达的ORF分析利用计算机和互联网，对核酸序列的所有相位进行搜索可以很快地获得ＯＲＦ结果。国际互联网上的ＯＲＦ分析资源有：/gorf/查找);http://expasy.hcuge.ch/www/dna.html(将ＤＮＡ翻译为蛋白质)。第20页，共81页，2023年，2月20日，星期六第21页，共81页，2023年，2月20日，星期六第22页，共81页，2023年，2月20日，星期六第23页，共81页，2023年，2月20日，星期六第24页，共81页，2023年，2月20日，星期六核酸序列的

比对分析第25页，共81页，2023年，2月20日，星期六对核酸序列的首要分析是联网进行序列的同源性分析，以便能够利用最新的数据库反映该序列是否是已知序列以及与已知序列同源性的高低。典型的分析是采用NCBI的BLAST软件对GENBANK中的非冗余数据库（non-redundantdatabase,nr）进行查询。该数据库是对GENBANK、EMBL和DDBJ中去除所有相同核酸序列进行整合后所得到的最为全面的已知基因数据库，其中还包括了部分基因组的序列。第26页，共81页，2023年，2月20日，星期六运行时联网至：/BLAST按照提示进行查询。第27页，共81页，2023年，2月20日，星期六ggggtcgagtccgcgtccacccgcgagtacaaccttcttgcagctcctccgtcgccggtc61cacacccgccaccagttcgccatggatgacgatatcgctgcgctcgtcgtcgacaacggc121tccggcatgtgcaaggccggcttcgcgggcgacgatgctccccgggccgtcttcccctcc181atcgtgggccgccctaggcaccagggtgtgatggtgggtatgggtcagaaggactcctac241gtgggcgacgaggcccagagcaagagaggcatcctgaccctgaagtaccccattgaacac301ggcattgtcaccaactgggacgatatggagaagatttggcaccacactttctacaatgag361ctgcgtgtggcccctgaggagcaccctgtgctgctcaccgaggcccctctgaaccctaag421gccaaccgtgaaaagatgacccagatcatgtttgagaccttcaacaccccagccatgtac481gtagccatccaggctgtgttgtccctgtatgcctctggtcgtaccactggcattgtgatg541gactccggagacggggtcacccacactgtgcccatctatgagggttacgcgctccctcat601gccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgacagactacctcatgaagatcctg661accgagcgtggctacagcttcaccaccacagctgagagggaaatcgtgcgtgacattaaa721gagaagctgtgctatgttgccctagacttcgagcaagagatggccactgccgcatcctct781tcctccctggagaagagctatgagctgcctgacggtcaggtcatcactatcggcaatgag841cggttccgatgccccgaggctctcttccagccttccttcctgggtatggaatcctgtggc901atccatgaaactacattcaattccatcatgaagtgtgacgttgacatccgtaaagacctc961tatgccaacacagtgctgtctggtggcaccaccatgtacccaggcattgctgacaggatg1021cagaaggagattactgccctggctcctagcaccatgaagatcaagatcattgctcctcct1081gagcgcaagtactctgtgtggattggtggctctatcctggcctcactgtccaccttccag1141cagatgtggatcagcaagcaggagtacgatgagtccggcccctccatcgtgcaccgcaaa1201tgcttctaggcggactgttactgagctgcgttttacaccctttctttgacaaaacctaac1261ttgcgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa//第28页，共81页，2023年，2月20日，星期六点击第29页，共81页，2023年，2月20日，星期六第30页，共81页，2023年，2月20日，星期六第31页，共81页，2023年，2月20日，星期六第32页，共81页，2023年，2月20日，星期六第33页，共81页，2023年，2月20日，星期六第34页，共81页，2023年，2月20日，星期六第35页，共81页，2023年，2月20日，星期六第36页，共81页，2023年，2月20日，星期六点击第37页，共81页，2023年，2月20日，星期六第38页，共81页，2023年，2月20日，星期六PCR引物设计第39页，共81页，2023年，2月20日，星期六PCR基本原理Mg2+AGGCTTAAGGGCATAGTAGGC-5’3’-TAATCCCGATTATCCCGT-3’AGGCCCCGTTTAACCCGTTTAATA5’--3’3’--5’AGGCTTAAGGGCATAGTAGGC5’-3’--5’CCCGTTTAACCCGTTTAACCGTA-3’TAATTA-3’5’-3’-TTAAGGGCATTAAGGGCATAGGC-5’80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃TTAAGGGCATAGTACCCGATTATCCCGT5’-第40页，共81页，2023年，2月20日，星期六因此，引物设计是整个工作的基础和关键。第41页，共81页，2023年，2月20日，星期六引物设计的原则1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp2.引物3’端出现3个以上的连续碱基，特别是GGG

或CCC第42页，共81页，2023年，2月20日，星期六引物设计的原则3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基。

4.5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

5.引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。第43页，共81页，2023年，2月20日，星期六引物二聚体Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第44页，共81页，2023年，2月20日，星期六引物二聚体Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第45页，共81页，2023年，2月20日，星期六引物二聚体Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第46页，共81页，2023年，2月20日，星期六发夹结构5’３’５’３’第47页，共81页，2023年，2月20日，星期六引物设计的原则

引物二聚体及发夹结构的能值过高:∆G≧4.5kcal/mol产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应效率降低。

第48页，共81页，2023年，2月20日，星期六引物设计的原则6.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。第49页，共81页，2023年，2月20日，星期六7.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算公式:

Tm＝4(G+C)＋2(A+T)引物设计的原则第50页，共81页，2023年，2月20日，星期六引物设计的原则8.∆G值是指DNA双链形成（或者打开）所需的自由能，该值反映双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。第51页，共81页，2023年，2月20日，星期六这么多要求烦死人了，我抗议！除非……第52页，共81页，2023年，2月20日，星期六常用的引物设计软件Oligo6（引物评价）*PremierPrimer（自动搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在线服务）*第53页，共81页，2023年，2月20日，星期六常用的引物设计软件PrimerPrimer5.0

的使用技巧简介1、软件安装与主要功能介绍2、引物设计应用举例第54页，共81页，2023年，2月20日，星期六常用的引物设计软件我们可以通过网上下载或其它方式获得安装软件1、软件安装与主要功能介绍第55页，共81页，2023年，2月20日，星期六2、引物设计应用举例引物分类：按PCR目的不同可分为检测引物和克隆引物两大类.常用的引物设计软件检测性引物特点:反应灵敏性、扩增特异性克隆性引物特点:产物完整性和保真性第56页，共81页，2023年，2月20日，星期六PCR引物设计应用举例

1ctgcaggccactggttaccgggaattgttccggtcaacgcggtattaggtggcgcgctga61gctatctgatccttaacccgattttgaatcgtaaaacgacagcagcaatgacgcatgtgg121aggctaacag

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