结核抗酸性染色

结核抗酸性染色第1页/共21页抗酸染色第2页/共21页一、实验目的：掌握抗酸染色的原理和方法抗酸染色第3页/共21页分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。二、实验原理：第4页/共21页三、实验材料：细菌：结核杆菌染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美兰溶液其它：接种环、酒精灯、载玻片等第5页/共21页四、实验方法：1、细菌涂片标本的制备涂片

干燥

固定2、染色3、油镜观察1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。2）脱色：3%盐酸酒精脱色30’’~1’；用水冲洗。3）复染：用碱性美兰溶液复染1’，用水冲洗后用吸水纸吸干。第6页/共21页五、实验结果：结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。第7页/共21页第8页/共21页六、注意事项：1、无菌操作2、涂片厚度要适中3、固定4、冲洗5、染色时间6、初染加热的温度，勿沸腾第9页/共21页结核杆菌的培养特点培养基：罗-琴氏（LowenateinJensen）培养基

主要成分：蛋黄；甘油；天门冬素；马铃薯淀粉；无机盐；孔雀绿；蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长，孔雀绿可抑制杂菌生长。第10页/共21页生长特点：缓慢；2-4周可见菌落；呈乳白色或米黄色，不透明，粗糙型颗粒状，结节状，菜花状菌落。

液体培养基中呈膜样生长。第11页/共21页溶菌酶的溶菌作用第12页/共21页目的要求了解溶菌酶的溶菌现象了解溶菌酶的杀菌机制第13页/共21页原理溶菌酶是正常体液和分泌液中所含的一种低分子量碱性蛋白，能水解G+菌细胞壁中的肽聚糖成分，致使细菌崩解。G-菌细胞壁肽聚糖层外面还有一层外膜，故一般情况下不受溶菌酶的影响。溶菌酶是非特异性免疫中一种重要的体液杀菌成分。第14页/共21页材料混有溶壁微球菌的1％琼脂平板人的唾液（含有溶菌酶）、PBS、溶菌酶标准品打孔器、针头、吸管、量尺第15页/共21页方法菌液的准备：溶壁微球菌在使用前于普通琼脂斜面传代一次，然后接种于普通琼脂斜面37℃培养24h。加pH6.4的1/15mol/L磷酸缓冲液，将菌苔洗下，用比浊法使每ml菌液含相当于2000亿菌体浓度，再以70℃水浴加热1h杀菌。称取1g优质琼脂加入pH6.4的1/15mol/L磷酸缓冲液100ml，加热溶解。第16页/共21页方法取1ml菌液加到50-60℃已溶化的琼脂内，摇匀，取15ml培养基倾注平板待凝。打孔打孔打5孔，边缘不能裂开，依次标记“1”-“5”于皿底；封底加样

1-5号孔分别加溶菌酶标准品、PBS、唾液1、唾液2、唾液3（以加满孔但又不溢出为宜）置于24-26℃，12-18h后测量加样孔周围溶菌环直径。第17页