zj基因工程(目的基因的合成完全)

第五章目的基因的获得现在是1页\一共有56页\编辑于星期一基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。现在是2页\一共有56页\编辑于星期一目的基因用途

①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。③研究生物种系进化与相关同源性。现在是3页\一共有56页\编辑于星期一④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。⑥建立基因治疗院，选用某种正常基因，引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。现在是4页\一共有56页\编辑于星期一挑出所要群落得到纯系转殖菌株大量培养生产人类胰岛素HumanInsulin探针Probe互补DNA专一性抗体送入宿主细菌基因接入载体目标基因剪接Stryer(1995)Biochemistry,p.119Kleismith&Kish(1995)CellandMolecularBiology,p.115现在是5页\一共有56页\编辑于星期一畜產系鄭登貴教授抗虫基因转殖烟草荧光基因转殖鱼抗老化转殖兰花基因转殖羊现在是6页\一共有56页\编辑于星期一几种生物的基因组比较病毒SV405.21环状大肠杆菌40001环状酵母1700017线状人5-7×10623线状种类大小（Kb）

染色体数形状现在是7页\一共有56页\编辑于星期一现在是8页\一共有56页\编辑于星期一目的基因需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系现在是9页\一共有56页\编辑于星期一目的基因的获取化学合成法cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应现在是10页\一共有56页\编辑于星期一第一节基因组文库的构建基因组文库的概念

某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息，则称为部分基因组文库。现在是11页\一共有56页\编辑于星期一1.1基因组文库构建的基本步骤

①细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；②载体DNA的制备；③载体与外源大片段的连接；④体外包装及基因组DNA文库的扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。现在是12页\一共有56页\编辑于星期一组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合基因组DNA文库的构建现在是13页\一共有56页\编辑于星期一限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装现在是14页\一共有56页\编辑于星期一现在是15页\一共有56页\编辑于星期一1.2基因组DNA的切割（制备）用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区第二，保证DNA片段大小均一超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。现在是16页\一共有56页\编辑于星期一1.3载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的λ-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒上述几种载体的最大装载量如下：

质粒15kbλ-DNA25kb考斯质粒45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌现在是17页\一共有56页\编辑于星期一1.4重组DNA分子的构建一般选择10uL的连接反应体系，其中DNA片段与载体臂之间的摩尔数比为2：1现在是18页\一共有56页\编辑于星期一1.5重组DNA分子导入受体细胞一般采用噬菌体颗粒的形式将重组DNA分子导入大肠杆菌细胞中，以提高建立基因文库的效率。现在是19页\一共有56页\编辑于星期一1.6基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：N：重组子的数量P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f：克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109

bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆现在是20页\一共有56页\编辑于星期一1.7基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选现在是21页\一共有56页\编辑于星期一1.8基因文库的扩增、分装及保存液体培养增殖法；影印滤膜培养法；制备转导性裂解物；现在是22页\一共有56页\编辑于星期一第二节cDNA基因文库构建

cDNA基因文库的概念

某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA文库。如果此群体中只贮存该基因组cDNA部分，则称为部分cDNA基因文库。

现在是23页\一共有56页\编辑于星期一2.1cDNA基因文库构建的步骤细胞总RNA的制备及mRNA的分离cDNA第一条链的合成双链cDNA的合成cDNA与载体的连接噬菌体颗粒的包装转染或质粒的转化现在是24页\一共有56页\编辑于星期一mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制从cDNA文库获取目的基因现在是25页\一共有56页\编辑于星期一尿素-氯化锂法硫氰酸胍法polyT亲和层析法密度梯度离心分级法探针筛选法2.1.1mRNA的提取与纯化AAAAAAAAAAAApolyTpolyTpolyT现在是26页\一共有56页\编辑于星期一2.1.2从mRNA制备cDNA逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链现在是27页\一共有56页\编辑于星期一cDNA第一链的合成现在是28页\一共有56页\编辑于星期一cDNA第二链的合成自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失现在是29页\一共有56页\编辑于星期一cDNA第二链的合成置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失现在是30页\一共有56页\编辑于星期一cDNA第二链的合成引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列现在是31页\一共有56页\编辑于星期一双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收2.1.3双链cDNA的克隆现在是32页\一共有56页\编辑于星期一2.2cDNA克隆的主要优点①cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。②cDNA基因文库的筛选比较简单易行。③每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。④cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。现在是33页\一共有56页\编辑于星期一2.3cDNA克隆的主要的缺点cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA基因文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息。在cDNA基因文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。

现在是34页\一共有56页\编辑于星期一第三节目的基因的获得3.1应用核酸探针分离克隆的目的基因当把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上后，就可以同特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆。这个过程叫做克隆基因的分离或筛选。现在是35页\一共有56页\编辑于星期一从基因文库中筛选目的基因现在是36页\一共有56页\编辑于星期一从cDNA文库钓取目的基因现在是37页\一共有56页\编辑于星期一需要解决的问题：1、核酸探针的来源；2、寡核苷酸探针的人工合成；（1）所合成的探针必须严格地只能同目的基因的cDNA序列互补；（2）遗传密码的简并问题；3、假阳性克隆的克服；现在是38页\一共有56页\编辑于星期一3.2应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因3.2.1差别杂交（differentialhybridization)；又叫差别筛筛选（differentialscreening)，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。3.2.2扣除杂交(subtractivehybridization)；又叫(subtractivecDNAcloning)，它是通过构建扣除文库得以实现的。现在是39页\一共有56页\编辑于星期一

差异分离程序利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能现在是40页\一共有56页\编辑于星期一现在是41页\一共有56页\编辑于星期一3.3应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有充的表达方式，叫做基因的差别表达。mRNA差别显示PCR（mRNAdifferentialdisplayreversetrnscriptionpolymerasechainreaction)，简称DDRT-PCR现在是42页\一共有56页\编辑于星期一原理：使用5`-T11MN或T12MN的锚定引物，以及5`端的随机引物来进行RT-PCR，从而整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的但序列结构不同的12份亚群。分别在标准测序胶上进行电泳即可分开差别表达的mRNA。现在是43页\一共有56页\编辑于星期一3.4应用表达文库分离克隆的目的基因将cDNA插入表达载体中，在大肠杆菌中得以表达后，使用特异性抗体为探针与表达产物进行反应后筛选。现在是44页\一共有56页\编辑于星期一3.5目的基因的化学合成全基因化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：小片段粘接法：

根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段现在是45页\一共有56页\编辑于星期一补钉延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段现在是46页\一共有56页\编辑于星期一大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段现在是47页\一共有56页\编辑于星期一DNA化学合成的用途合成天然基因如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等修饰改造基因如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等设计新型基因制备探针、引物、接头现在是48页\一共有56页\编辑于星期一化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列现在是49页\一共有56页\编辑于星期一探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往只知道目的基