微生物之棒状杆菌

微生物之棒状杆菌第1页，共22页，2023年，2月20日，星期六内容概要棒状杆菌属及白喉棒状杆菌简介棒状杆菌与疾病常用种属鉴定靶点及序列比对棒状杆菌毒力因子及序列比对文献第2页，共22页，2023年，2月20日，星期六棒状杆菌属及白喉棒状杆菌简介棒状杆菌属(Corynebacterium)是一群革兰染色阳性杆菌。本属细菌的特点是菌体一端或两端膨大呈棒状，菌体染色不均匀，可出现异染颗粒。该菌属无荚膜、无鞭毛，不产生芽胞。种类较多，广泛分布于动、植物。可在人体皮肤、上呼吸道和泌尿生殖道粘膜等处定居。大多为非致病菌或条件致病菌，其中白喉棒状杆菌是唯一能引起人类致病且具较强传染性的菌种。白喉棒状杆菌的异染颗粒（Albert染色）第3页，共22页，2023年，2月20日，星期六白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)，俗称白喉杆菌，是白喉的病原菌。白喉是一种急性呼吸道传染病，患者咽喉部粘膜可出现灰白色的假膜。该菌能产生强烈外毒素，进入血液可引起全身中毒症状。菌体细长微弯，一端或两端膨大呈棒状。细菌排列不规则，常排列呈V、L等形状。革兰染色阳性。用美蓝短时间染色菌体着色不均匀，出现有深染的颗粒。用Neisser或Albert等法染色，这些颗粒与菌体着染颜色不同，称为异染颗。颗粒的主要成分是核糖核酸和多偏磷酸盐，在鉴定时有重要意义。但当细菌衰老时异染颗粒被消耗而不明显，且细胞壁变薄易被脱色，常造成革兰染色不定，有时可表现为在革兰阴性的菌体中见有阳性颗粒或节段。需氧或兼性厌氧。在血平板上可生长，菌落大小1~3mm。在含有凝固血清的吕氏血清斜面上生长迅速，涂片染色异染颗粒明显。分离培养时常用亚碲酸钾血平板作为鉴别选择培养基。因亚碲酸钾能抑制杂菌，而白喉棒状杆菌不受影响，并能吸收亚碲酸盐使其还原为黑色的金属碲，菌落呈黑色。白喉棒状杆菌在亚碲酸钾血平板上可形成三种不同形态特征的菌落，分别称为重型、轻型和中间型。三型的产毒株与疾病的轻重程度无明显的对应关系，但对流行病学分析具有一定意义。在我国以轻型多见。白喉棒状杆菌对湿热抵抗力不强，58C10分钟或煮沸1分钟死亡。但对寒冷、干燥和日光的抵抗力较其他无芽胞菌强。在衣服、床单、玩具上可存活数天至数周。对常用消毒剂抵抗力较弱，5%石碳酸1分钟、3%来苏尔10分钟处理可杀灭。对青霉素、氯霉素、红霉素等敏感。第4页，共22页，2023年，2月20日，星期六棒状杆菌与疾病棒状杆菌种名临床疾病与症状C．diphtheriae临床上引起白喉，主要侵犯口咽、鼻咽等部位，局部形成灰白色假膜，有咽白喉、喉白喉、鼻白喉和气管白喉之分。其产生的外毒素可损害心肌和神经系统，病死率高，死亡的病例中50%以上是由于心肌受损发展到充血性心力衰竭所致，可引起心肌炎、软腭麻痹、声嘶、肾上腺功能障碍等症状。此外，本菌可侵犯眼结膜、外耳道、阴道和皮肤伤口C．pseudodiphtheriticum偶尔可引起心内膜炎、尿路感染、骨感染C．ulcerans可产毒素，引物呼吸道白喉样疾病，也与奶牛乳腺炎有关C．amycolatum可引起心内膜炎C．striatum关节炎，败血症C．jeikeium在免疫抑制或免疫功能不全的人身上引起机会性感染，比如骨髓移植中引起的机会性感染，也可引起关节炎，心内膜炎，败血症。C．urealyticum可引起泌尿道感染，产生大量尿素酶使尿液变碱，易导致结石形成。C．xerosis常寄居于眼结膜，可引起关节炎，心内膜炎，胸膜肺炎，腹膜炎，骨髓炎，脓毒性关节炎，脑膜炎等。C．pseudotuberculosis可引起小反刍动物干酪样淋巴结炎C．bovis可引起牛乳房炎C．renale引物牲畜膀胱炎和肾盂肾炎C．pyogenes从牛、羊和猪的化脓性损伤中分离到，跟奶牛乳腺炎有关，人类感染已有报告.第5页，共22页，2023年，2月20日，星期六常用种属鉴定靶点及序列比对靶微生物基因生理功能特异性敏感性备注C.pseudotuberculosis16S[1,11]核糖体RNA假阳性—与C.ulcerans交叉C.diphtheriaeC.ulceranstox[2,5,6,8,9,10,12,13,14]白喉毒素假阴性10copiesperreactiontube某些菌株不含有此基因C.diphtheriaeC.ulceransrpoB[2,11]RNA聚合酶亚基B—10copiesperreactiontubeC.diphtheriaedtxR[3,12]代谢调节和毒素合成调节因子100%—C.pseudotuberculosisrpoB[4]RNA聚合酶亚基B100%1pg和16S联用3重PCR特异性达100%，敏感性达1pgC.pseudotuberculosisPld[4]外毒素PLD100%1pg第6页，共22页，2023年，2月20日，星期六靶微生物基因生理功能特异性敏感性备注C.JeikeiumC.urealyticum16S-23S[7]核糖体RNA间区————16S-23S序列多态能够清楚区分这两个种第7页，共22页，2023年，2月20日，星期六种属鉴定靶点的选定16S作为国际公认的细菌分类“金标准”，作为细菌属的鉴定靶点是得到认可的，在已下载到的棒状杆菌文献中，缺乏关于棒状杆菌属鉴定靶点的描述，介于16S在分类上应用的普遍性和权威性，在此将16S暂定为棒状杆菌属的鉴定靶点。代谢调控因子编码基因dtxR和RNA聚合酶亚基B编码基因rpoB是白喉棒状杆菌鉴定讨论最多的靶点，特别是dtxR在白喉的鉴定中表现出良好的特异性，现将dtxR作为白喉的首选鉴定靶点，rpoB作为备选，以区分白喉和非白喉。换句话说，只要16S显阳性，排除假阳性的结果，就认为是棒状杆菌属的细菌，再加上dtxR和rpoB显阳性，排除假阳性结果，就说明是白喉，如果是阴性就说明是棒状杆菌的其他种，其他种在这不进行细致的鉴定。第8页，共22页，2023年，2月20日，星期六临床上棒状杆菌中的致病种包括白喉棒状杆菌在内，有36个种，然而在此不可能将数目众多的种都考虑进去，产毒白喉棒状杆菌（C．diphtheriae）是最主要的致病种，也是绝对致病种，在本课题中作为重点考虑，此外，在16S的比对中将条件致病种C．pseudodiphtheriticum，C．ulcerans，C．amycolatum，C．striatum，C．jeikeium，C．urealyticum和C．xerosis考虑进去，另加跟牛乳腺炎有关的2个种：C．bovis和C．pyogenes。第9页，共22页，2023年，2月20日，星期六16S序列比对选取白喉棒状杆菌（C.diphtheriae）等10个种的16S序列进行比对，共计278条序列。棒状杆菌属鉴定16S-1第10页，共22页，2023年，2月20日，星期六由于文献都是直接用靶基因鉴定到种，没有用16S属的鉴定棒状杆菌属的引物，属引物还需自行设计。第11页，共22页，2023年，2月20日，星期六dtxR序列比对选取白喉棒状杆菌21条dtxR序列进行比对。第12页，共22页，2023年，2月20日，星期六文献中dtxR引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location产物长度(bp)白喉[3]GGGACTACAACGCAACAAGAACAACGGTTTGGCTAACTGTA568-588809-828260第13页，共22页，2023年，2月20日，星期六rpoB序列比对选取白喉（C．diphtheriae）等9个种的rpoB序列进行比对，合计102条。第14页，共22页，2023年，2月20日，星期六文献中的棒状杆菌rpoB引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location产物长度(bp)C.Pseudotuberculosis[4]CGTATGAACATCGGCCAGGTTCCATTTCGCCGAAGCGCTG2767-27863208-3227446第15页，共22页，2023年，2月20日，星期六棒状杆菌毒力因子及序列比对种主要毒力因子相关基因分布率备注C．diphtheriae白喉毒素（DT）Tox[2,3,5,8,11,12,14，15]54%[5]该种某些菌株不携带该毒素，为溶原噬菌体携带,A,B两个亚基组成,有的菌株只有A亚基，有的只有BC．ulcerans白喉毒素（DT）Tox[2,8,10]11/20[9]A,B两个亚基组成外毒素PLD（鞘磷脂酶）PLD[4]__C.pseudotuberculosis外毒素PLD（鞘磷脂酶）PLD[4]100%[4]_第16页，共22页，2023年，2月20日，星期六白喉毒素tox基因比对选取13株C.diphtheriae的白喉tox基因和15株C.ulcerans的tox基因进行比对。第17页，共22页，2023年，2月20日，星期六文献中白喉毒素tox引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location产物长度(bp)C．Diphtheriae[2]AndC．ulceransTGAAACCCGTGGAAAACGAGACTCTATCTTTGTCTTAGCGTGTCAGGCGATCAGTAGGT(diphtheriae)CTCATTGTCATGCATAAATCTTGAT(ulcerans)576-593713-732643-663666-690156C．DiphtheriaefortoxAsubunit[16]GAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCA118-137338-366248C．DiphtheriaefortoxBsubunit[16]ATACTTCCTGGTATCGGTAGCCGAATCTTCAACAGTGTTCCA991-10111267-1287297白喉毒素又A,B2个亚基组成，但某些菌株只存在一种亚基，另一亚基丢失的情况，建议针对这两个亚基分别设计1对引物检测，方能对菌株是否含有白喉毒素进行准确定性。第18页，共22页，2023年，2月20日，星期六鞘磷脂酶PLD基因比对选取10株C.ulcerans的PLD基因进行比对选取17株C.pseudotuberculosis的PLD基因进行比对第19页，共22页，2023年，2月20日，星期六文献中PLD引物Targetmicro序列（5'-3）'Location产物长度(bp)C.pseudotuberculosis[4]ATAAGCGTAAGCAGGGAGCAATCAGCGGTGATTGTCTTCC506-525689-708203第20页，共22页，2023年，2月20日，星期六参考文献[1]BurhanC¸etinkayaa,*,MuratKarahana,ErayAtila,etal.IdentificationofCorynebacteriumpseudotuberculosisisolatesfromsheepandgoatsbyPCR[J].VeterinaryMicrobiology88(2002)75–83.[2]FabiolaMancini,MonicaMonaco,MarcoPataracchia,etal.IdentificationandmoleculardiscriminationoftoxigenicandnontoxigenicdiphtheriaCorynebacteriumstrainsbycombinedreal-timepolymerasechainreactionassays[J].DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease73(2012)111–120.[3]FabriciaP.Pimenta,GiseleA.M.Matias,GabrielaA.Pereira,etal.APCRfordtxRgene:Applicationtodiagnosisofnon-toxigenican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