人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究

中国药科大学本科生毕业论文（设计）PAGEPAGE20中国药科大学本科毕业论文论文题目人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究英文题目ResearchonPreparationofHumanParathyroidHormoneFragmentAnalogue专业生物技术院部生命科学与技术学院学号姓名指导教师课题完成场所中国药科大学酶工程实验室论文工作时间：年月至年月

人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究目录摘要………………………1前言………………………2实验原理………31.1…………………31.2…………………3第二章试剂与仪器……………………42.1试剂……………………42.2仪器……………………4第三章实验方法………53.1XXXXXXXX……………53.2XXXXXX………………5第四章实验结果………64.1XXXXX…………………64.2XXXXXXX………………64.3XXXXXXXXX……………6第五章讨论……………参考文献…………………7致谢………………………9

人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究0342223罗娜摘要：目的提高人甲状旁腺素活性片段前体物Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro的分离纯化效率。方法①通过均匀设计法寻求目的融合蛋白的酸水解条件（温度、时间、蛋白含量，盐酸浓度）；进行二次酸水解。②使用核酸蛋白检测仪及紫外可见分光光度计检测210nm，280nm处吸收峰，收集样品峰，对比含量及纯度差异，确定最佳检测波长。结果①酸水解最佳条件没有得到改进；②检测波长设在210nm比设在280nm更灵敏、更可靠。结论①二次酸水解可提高水解效率；②检测波长设在210nm处可提高分离纯化效率。关键词：人甲状旁腺素，活性片段前体物；骨质疏松；纯化；酸水解；柱层析ResearchonpreparationofhumanparathyroidHormonefragmentanalogueAbstract：ObjectiveToimprovetheseparationandpurificationrateofhumanparathyroidhormonefragmentanaloguePro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro.Methods①Toseektheconditionsforacidhydrolysisoftargetfusionproteinthroughuniformdesign；tocarryoutacidhydrolysisforasecondtime.②Todetecttheassimilationpeakandthesamplecollectingpeakat210nmand280nmwiththenucleicacidproteinsurveymeterandtheultravioletvisiblelightphotometer，andtocontrastthedifferencesincontentsandpuritytomakesurethebestwavelength.Results①Noprogresswasmadeinseekingthebestconditionsofacidhydrolysis;②Setupthedetectingwavelengthat210nmwasmoresensitiveandcrediblethenat280nm.Conclusions①Carryingoutacidhydrolysisforasecondtimecanimprovetheefficiencyofhydrolysis;②Settingupthedetectingwavelengthat210nmcanimprovetheseparationandpurificationrate.Keywords：humanparathyroidhormone;activefragmentanalogue;osteoporosis;purification;hydrochloricacid;columnchromatography前言一、骨质疏松症以及研究开发甲状旁腺激素相关肽的重大意义骨质疏松是一个涉及多学科的公众健康问题。它是指每个单位内骨组织数量减少。分为继发性骨质疏松和原发性骨质疏松，前者最常见有类固醇性骨质疏松和糖尿病性骨质疏松等，后者主要包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。原发性骨质疏松是以骨质减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。判断骨质疏松症的依据为：骨量减少；骨微结构蜕变；骨的脆性增高、骨力学强度下降、骨折危险性增加，对载荷承受力降低而易于发生微细骨折或完全骨折。造成骨质疏松的原因有：绝经后和老年性骨质疏松；遗传性骨质疏松；内分泌疾患所致骨质疏松；与饮食有关的骨质疏松；药物所致骨质疏松；废用性骨质疏松；其它疾病所致骨质疏松；特发性骨质疏松[1]。现今骨质疏松症已成为严重威胁老年人身心健康的常见疾病，根据中国老年学学会骨质疏松学会统计，目前骨质疏松症患者人数在我国已达到8千万，已经构成一个严重的公众健康问题。随着人均寿命的延长，老年性骨质疏松症发病率逐年增加。同时骨质疏松症也特别“垂青”女性，在胎儿期，孩子从母体不断地吸收大量钙质，以保障骨骼的正常发育。授乳期，孩子通过母亲的乳汁得到赖以生长的钙。这时期的孕妇或授乳期母亲必须有意识地多摄取一些钙质，才能满足孩子和自身的需求。否则，不足部分便会有母亲的骨组织中溶出。在绝经期，妇女也受到骨质疏松的困扰。对于正常人，性激素对骨组织合成的促进作用和肾上腺皮质激素对骨形成的拮抗作用处于动态平衡。当性激素水平下降，而肾上腺功能并无相应程度降低，结果造成糖皮质激素相对增多，产生类似柯兴氏综合症的表现，使骨吸收大于骨形成。雌激素具有刺激成骨细胞活性促进骨基质合成的作用。雌激素缺乏不仅影响妇女的生活，更可能引发两种由于雌激素缺乏造成的疾患：心血管疾病和骨质疏松。骨质疏松造成妇女在一生中发生髋骨骨折的危险性高于其患乳腺癌、宫颈癌、子宫癌和卵巢癌危险的总和。据调查显示，60岁以上的女性骨质疏松率高达40%，而且随年龄段增加，比例也在上升。因此，抗骨质疏松药物的研制是世界制药工业的一个热点。在目前应用的经典抗骨质疏松药物中，绝大部分为抑制破骨细胞活性的药物，如雌激素、降钙素、双膦酸盐等，但缺乏刺激成骨细胞活性或既刺激成骨又抑制破骨的作用，因而不能使骨组织恢复到正常的强度和密度[2]。甲状旁腺激素（parathyroidhormone，PTH）是生物体内由甲状旁腺主细胞分泌的一种多肽激素，由84个氨基酸组成。他是哺乳动物体内重要的钙、磷调节因子[3]，而PTH的分泌也受到血钙水平的反馈调节。实验表明：PTH（1-27）仍保持有一定体外活性，而PTH（1-26）则完全丧失体内外活性。hPTH(1-34)在体内外保持有完整PTH的几乎全部生物活性[4]。而合成的牛甲状旁腺素片段（bovineparathyroidhormonefragment(1-34)，bPTH-(1-34)）比天然激素bPTH（1-34）的活性更高。大量的临床研究表明，PTH及其片段的小剂量多次给药具有明显的成骨作用。由于PTH及其相关肽不但能防止骨裂解，而且能促进骨生长，对疏松骨具有恢复作用，因此被认为是治疗骨质疏松症的第二代首选药物。二、PTH的生物合成过程及作用机制人甲状旁腺激素是由甲状旁腺分泌的84个氨基酸组成的多肽，最初的转译产物是前甲状旁腺激素原（ProhPTH），由115个氨基酸残基构成，在分泌过程中首先在粗面内质网膜周质腔被信号肽切除Ｎ端25个氨基酸的信号肽部分成为甲状旁腺激素原（prohPTH），然后在高尔基体中切掉6个氨基酸的前体部分成为84肽成熟激素。而84肽在体内可降解成Ｎ端（1-34）肽等活性片段[1]。在哺乳动物中，PTH主要生理作用是维持血钙平衡，PTH的合成和分泌很大程度上受到甲状旁腺敏感受体介导的胞外钙浓度的调节：低血钙时，PTH分泌到血循环系统，结合于肾和骨靶细胞上的Ⅰ型PTH受体（PTH1R，此受体被PTH及PTHrP共同分享），通过对靶细胞直接或间接的作用帮助血钙维持在一定范围。而血钙升高又抑制其分泌，但无论血钙浓度多高，均不能完全抑制其分泌。在肾脏中，PTH直接刺激肾近区小管对钙的重吸收以及刺激1α-羟化酶的活性，增加肠内1，25－二羟基维生素D3介导的钙吸收；在骨骼中，PTH能诱导钙从基质中快速释放，增加破骨细胞的数目及活力，促进骨吸收，同时增加成骨细胞的数目，促进成骨细胞释放骨生长因子加速骨形成。另外，PTH还可能通过抑制肾近区小管和远区小管对磷的重吸收十血磷浓度维持在正常范围。三、PTH结构与生理功能的关系1978年Keutmann等报道了人PTH的一级结构。认为hPTH是由84个氨基酸残基组成的一条多肽链分子，分子中不含半胱氨酸，故分子中不含二硫键[6]。Tregear等用实验证明PTH发挥钙磷调节作用仅需氨基端1-34个氨基酸残基[7]。园二色谱研究结果表明在水溶液中PTH分子是伸展的无固定的高级结构。而且不论是整个分子还是氨基片段都显示了一些pH依赖性，即随pH的变化观察到的结构也有所不同，肽链中增加了少量的二级结构。荧光研究也显示了相似的结果[8]。利用1H-NMR人们发现在第20-24氨基酸残基的地方有少量的规则结构，但在水溶液中仍难以观察到PTH的二级或三级结构。进一步用NMR研究表明，hPTH1-34在Ser3到Gly12及Ser17到Lys26两处有一α螺旋结构。着两个结构紧密的区域由一段无规卷曲或螺旋结构相连[19]。由于PTH缺乏二硫键，因此在水溶液中无典型的结构。只有在非记性类膜环境中才能形成二级或三级结构，大部分多肽均形成两性螺旋结构，这样的螺旋结构在与受体结合时发挥重要作用。研究发现，人甲状旁腺素N端α-螺旋和C端α-螺旋被结构随环境而改变的连接区相连。N端α-螺旋的N末端及C端α-螺旋的C末端为柔性区。N端是负责生理活性的片段，C端是负责受体结合的片段。将N末端的NH3+置于受体的信号传导部位是hPTH（1-34）发挥生理活性所绝对必要的，N末端三肽一定的柔性以及连接区的柔性也许可协助将N末端的NH3+引入受体中正确的部位这一相配过程。此外，hPTH（1-34）的Ser1，Gly12，Lys13，Arg20等氨基酸在hPTH（1-34）发挥生理活性时起着更特殊的作用[4]。四、上市情况：重组人甲状旁腺激素作为主要应用于低血钙导致的骨质疏松症治疗药物[10，11]，目前成为国内外研究开发热点之一。在国外，2021年美国食品与药物管理局批准使用重组人甲状旁腺素治疗骨质疏松症。这类药物被称为骨合成药。美国Allelix公司的重组hPTH（1-84）已进入Ⅲ期临床，美国Lilly公司的重组hPTH（1-34）（商品名Forteo®）已完成临床试验并已于2021年11月获FDA批准上市；美国NPS医药公司的rhPTH（1-34），商品名PREOS（原加拿大Allelix公司的Alix-11）于2021年9月完成Ⅲ期临床研究；加拿大ZelosOstabolin-C(TM)，鼻腔喷雾制剂已完成Ⅰ期临床研究。目前，国内已有多个厂家及科研机构从事重组rh-PTH（1-34）产品的研究和开发工作，由于大1量化学合成PTH有困难，PTH及其类似物的基因工程生产成为研究主要方向。第一章实验原理1.1表达菌体来源本实验室已成功构建表达菌体。此菌体以大肠杆菌BL-21为宿主菌，pET-28a为表达载体，天门冬酰酶Ⅱ切除信号肽的C末端片段为融合伙伴，在融合伙伴和目的肽结合处引入-Asp-Pro-酸敏感位点及二肽酶IV识别的C端和N端Pro-Pro-位点，并突变11位的亮氨酸为精氨酸。后经乳糖诱导T7启动子高效表达。表达的核苷酸酸序列为：(共38个)Ccaccgtccgtttccgaaatccaactgatgcataatcgtggtaaacatctgaactccatggaacgtgttgaatggctgcgtaagaaactgcaggatgtacataacttcccgccg可编码具有下术序列所示的蛋白质：ProProSerValSerGluIleGlnLeuMet10HisAsnArgGlyLysHisLeuAsnSerMet20GluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu30GlnAspValHisAsnPheProPro381.2均匀设计法的选择在酸水解过程中，温度，水解时间，所用盐酸浓度以及蛋白质含量多少对酸水解得率都有着不同程度的影响。王春晓在《两种新型人甲状旁腺素活性片段类似物研究》中使用均匀设计法对重组人甲状旁腺素类似物Pro-Pro-hPTH(1-34)进行了影响因素的研究。断定48℃、30h，50mmol/L，5%状态下为最佳酸水解条件。均匀设计法区别于正交实验设计法的主要特点是：实验次数少，每个因素每个水平只做一次试验；试验结果数据利用电子计算机处理，方便、快速、准确，可以定量地确定各因素对实验结果的影响，定量地预报优化条件及优化结果的区间估计。在本实验中，使用此法对目的小肽Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro的最佳酸水解条件进行确定。1.3检测波长的选择在倪国华的《凝胶过滤分离鸡肉蛋白酶解物时紫外检测波长的选择》[12]一文中，叙述了在小肽的分子结构中能产生紫外吸收的实际上只有肽键和氨基酸的侧链基团。当肽键在200-300nm波长范围内的吸收峰已经确定的条件下，分析不同氨基酸的侧链结构在200-300nm范围内的吸收情况，分析结果表明：在小肽的分子结构中，200-220nm处的吸收峰主要是由肽键产生的，270-290nm范围内的吸收主要是由芳香氨基酸侧链的大π键产生的.当洗脱液在200-220nm无吸收时，检测波长设在200nm-220nm比设在250nm-300nm更灵敏、更可靠。

第二章试剂与仪器2.1试剂2.1.1试剂来源抗生素硫酸卡那霉素（Kan）AMRESCo分装小肽电泳用试剂丙烯酰胺Sigma公司甲叉双丙烯酰胺Sigma公司TricineAMRESCo公司甘油（Glycerol）南京化学试剂拷马斯亮蓝R-250Fluka公司过硫酸铵上海前进试剂厂四甲基乙二胺上海前进试剂厂三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）GenebaseGene-TechCo.Ltd十二烷基硫酸钠（SDS）GenebaseGene-TechCo.Ltdβ-巯基乙醇SERVA公司发酵用试剂乳糖北京益理精细化学泡敌上海华联制药酸水解及分离纯化用试剂浓盐酸南京化学试剂氢氧化钠南京化学试剂氨水南京化学试剂CM52离子纤维素树脂Whatman公司（No.4037050）SephadexG-25Pharmacia公司醋酸铵南京化学试剂冰醋酸 南京化学试剂2.1.2培养基LB培养基Trypton上海生工生物工程Yeastextract OXOIDNaCl南京化学试剂AgarGenebaseGene-TechCo.Ltd玉米浆培养基牛肉浸膏上海化学试剂厂玉米浆常州生化厂味精（谷氨酸钠含量≥99%）河南莲花味精股份2.1.3培养基配方LB培养基Yeastextract0.5%(OXOID)，Tryptone1.0%(OXOID)和NaCl1%，加蒸馏水配制，高压灭菌，加卡那霉素（50μg/ml）备用。玉米浆培养基玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L，高压灭菌后，加卡那霉素使用。2.1.4缓冲液&溶液小肽电泳：阳极缓冲液：Tris0.2M，pH8.9阴极缓冲液：Tris0.1M，Tricine0.1M，SDS0.1%染色液：R-250(w/v)0.25%，乙醇:乙酸:水（45:10:45）脱色液：乙醇:乙酸:水（40:4:56）SDS凝胶电泳1*Tris-Gly电极缓冲液：Tris25mM，Glycine250mM，SDS0.1%考马斯亮蓝染色液：甲醇:水:冰乙酸（45:45:10），溶液中含0.25%（w/v）考马斯亮蓝R-250考马斯亮蓝脱色液：甲醇:水:冰乙酸（45:45:10）2*SDS加样缓冲液：Tris-HCl(pH6.8)100mmol/Lβ-巯基乙醇10%SDS4%菌体裂解缓冲液：Lysozyme(溶菌酶)0.02%TritonX-1000.5%(v/v)Tris-HClpH8.0750mmol/L包涵体洗涤液：TritonX-1000.2%Tris-HClpH8.0750mmol/L包涵体裂解缓冲液：尿素4mol/LTris-HCl(pH8.0)100mmol/L2.2仪器GL20A全自动高速冷冻离心机湘西仪器仪表总厂机械仪器厂TGL-16G型台式离心机上海安亭科学仪器厂制造立式万用电炉上海圣欣科学仪器马头牌架盘药物天平上海医疗器械八厂HL-1B数显恒流泵上海沪西分析仪器厂磁力搅拌器上海司乐仪器TH-500梯度混合器上海沪西分析仪器厂HDJ-2B核酸蛋白检测仪南京大学HD-A电脑采集器南京大学D-1型自动蒸汽灭菌锅北京发恩科贸GKCR112可控硅控温水浴锅上海跃进医疗器械厂GalanzWP750中型机械微波炉SW-CJ-1B 标准净化工作台苏州净化设备厂电子天平上海精密科学仪器TY-80S脱色摇床南京大学DY602V稳流稳压电泳仪南京大学生物化学系752紫外光栅分光光度仪上海第三分析仪器厂BS-100A自动部分收集器上海市沪西仪器厂BIOSTATC20-3型自动发酵罐B.BraunBiotechInternational，Germany第三章实验方法3.1发酵与表达3.1.1培养基的选择将菌体置于LB培养基中培养，在0h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h检测OD600及pH变化。将同批次菌体置于玉米浆培养基中培养，在0h，1h，2h，3h，4h，5h，6.5h，7h，8h，9h，10h检测其OD600及pH变化。3.1.2玉米浆中乳糖诱导表达量的确定按4.1.1中流程处理发酵，加入乳糖后，分别在0h，1h，2h，3h，4h，4.5h，5h，6h，6.5h，7h取样，SDS电泳后扫描胶体，分析，确定表达量。3.1.3菌体发酵诱导前生长时间的确定在发酵罐中培养菌体，在0h，1h，2h，2.75h，3h，3.33h，3.5h取样，测定OD600值，描绘曲线，确定最佳生长时间。4.1.4菌体诱导最佳时间的确定在发酵罐中，加入乳糖后，分别诱导0h，1h，2h，3h，4h，4.5h，5h，6h，6.5h后取样，测定OD600值，描绘曲线，确定最佳诱导时间。3.2分离纯化3.2.1发酵后，8000rpm离心5min收集菌体。将离心收集得到的菌体按4ml/g加入菌体裂解缓冲液中混匀，37℃3.2.2用等体积蒸馏水室温下搅拌洗涤上面的沉淀一次，溶液混匀后，12021rpm离心20min去上清。再用等体积2M尿素同样洗涤一次，得包涵体。每克包涵体按照8ml/g加入包涵体裂解缓冲液混匀，室温下连续震荡20h至包涵体溶解，12021rpm离心20min，收集上清。3.2.3用0.68V预冷乙醇边搅拌边缓慢加入包涵体裂解液中沉淀杂蛋白，-20℃静置20min后，12021rpm离心20min收集上清，同样再用终体积为融合蛋白的酸水解考察是否可以进行二次酸水解用50mMHCl溶解融合蛋白（含量为5%）后，48℃下水浴下水解30h。将水解产物调至融合伙伴的等电点p酸水解条件的摸索方法按均匀设计对酸水解条件进行考察。按下述因素安排表设置条件进行酸水解，不同时间采样，采用均匀设计软件进行分析。同时，比较水解时间，水解温度，盐酸浓度以及蛋白浓度的不同组合所产生的水解效果。`Group\FactorTime，hrTemp，℃[HCl]，mMFusionpro.Percentage120435510.5225531008.533063406.543538854.554048252.564558700.57506811512.5制胶方法：制分离胶Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.)1.5mLTris-Cl(8.45)1.5mLddH2O0.9mLGlycerol0.6mL10%AP10μLTEMED7μL制间隙胶Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.)0.3mLTris-Cl(8.45)0.5mLddH2O0.7mL10%AP10μLTEMED4μL制浓缩胶Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.)0.2mLTris-Cl(8.45)0.62mLddH2O1.68mL10%AP10μLTEMED4μL上样将各组条件下的样品溶于上样缓冲液中，根据浓度不同在各个样孔加入不同的量。电泳阳极液为0.2MTris.HCl(8.9)，阴极液为0.1MTricine(pH8.25)，0.1%SDS.110V恒压电泳。3.2.5将水解产物调节至等电点离心除沉淀后，将上清再调节至与洗脱液基本一致的pH值，透析或稀释至原水解液体积的十倍左右，流动上样于用0.09M乙酸铵平衡好的CM52离子交换柱，将0.09M乙酸铵（500mL）对0.28M乙酸铵（500mL）进行梯度洗脱，收集样品峰。检测波长先选在280nm处，将处理好的上清液进行离子交换，用核酸蛋白检测仪检测，并收集样品峰。再将检测波长选在210nm处，将收集的样品进行离子交换处理，用BS-100A自动部分收集器收集，再用紫外可见分光光度仪对每管进行吸光度检测，绘制出210nm吸光度图谱。对两波长下收集的样品峰的总量和纯度进行比较。确定最佳检测波长。3.2.6透析用蒸馏水进行，约3-4次，历时两天左右。3.2.7浓缩、除菌、过滤。3.2.8制半成品原液浓缩到小肽含量为1mg/ml后，加入稳定剂，除菌过滤后得半成品。3.2.9冻干，纯度检测成品-20℃第四章实验结果4.1表达与发酵4.1.1

Fig1Fig2Fig3时间，hpH0pH6.4-6.71pH6.4-6.72pH6.4-6.73pH6.4-6.74pH6.4-6.75pH6.4-6.76.5pH6.4-6.77pH6.4-6.78pH6.4-6.79pH6.4-6.710pH6.4-6.7table2pH-timeunderusingcornliquid从诱导时间上看，在Fig1中可以看出，菌体在LB中生长很好，OD600值迅速冲上0.5-0.6这个最佳诱导范围。在Fig3中可以看出，菌体在玉米浆中生长，3小时就可处在OD6000.5-0.6诱导范围；从价格上看，LB培养基价格较贵，玉米浆较便宜；从pH值方面考虑，比较Fig2和table1可以看出，菌体在LB中pH主要在6.9-7.7之间变化，菌体在玉米浆中pH主要在6.4-6.7之间变化，菌体在玉米浆中pH环境更稳定，更适合发酵过程中pH的控制。综合考虑，可采用如下流程处理发酵过程：配制LB培养基→加入1‰卡那和1.5‰菌液→37℃净化台操作↓倒入配制玉米浆培养基→加入0.5‰卡那→与其他未加入菌液的玉米浆培养基共同加入到自动发酵罐中→发酵预处理→发酵→收菌。4.1.2玉米浆中乳糖诱导表达量的确定012344.5566.57（h）Fig4.SDSanalysisoftheAnsB-C-hPTH（1-34）fusionproteinstainedwithCoomassieBlueunderreducingcondition.SamplesoftotalcellproteinwerepreparedbydisslovingcellsinLaemimlisamplebufferandboilinginthepresenceofβ-mercaptoethanolfor5min，andanalyzedona15%gel.lane1，totalcellproteinofBL21，control;Lane2-9，cellssamplewithpET28ansB-C-hPTH（1-34）afterinducedwithlactose1h，2h，3h，4h，4.5h，5h，6h，6.5h，7hrespectivlely.Rows(amount)(amount)(amount)(amount)(amount)(amount)(amount)(amount)(amount)(amount)r12.162.25721.60471.9111.64531.67831.98441.8762.07861.5387r23.69662.97621.92722.55012.10862.4072.32312.53523.17022.1716r34.56123.64112.4722.99672.45252.97823.21552.86894.13573.1386r40.370810.328340.476620.614790.553871.33770.57914r52.56751.2440.759810.935890.69170.801990.973980.852793.54430.98268r62.16161.86371.31990.672830.830711.26130.901811.32930.91208r718.47418.17815.09712.7257.95517.51616.36017.11116.847.3581r81.63841.63411.61991.75911.45851.6626r920.49133.21527.47724.64225.25426.07926.73426.49522.50326.92r106.76516.98317.26056.16089.87786.87136.29736.06036.14477.7588r114.55192.93431.54081.73112.58312.94781.92461.51262.32021.9274r120.888910.490250.553380.496770.574660.76867r130.640070.477040.485430.203760.391580.465920.32141r143.554.364637.163r151.77261.499129.21334.53135.13535.98935.69635.6228.939r168.49165.89672.72843.12982.67262.90833.59993.07125.71522.7961r1715.3015.22932.97922.65732.94872.94772.8973.04444.14932.3291r187.61687.8913.7393.67013.83283.54233.53564.84156.33431.9931Sum100100100100100100100100100100InLane100100100100100100100100100100Table3ExpressionlevelofPro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Prodensitometricanalysis由表2的r15一行数据可以看出，一定范围内，随着诱导时间的延长，融合蛋白的表达的菌体总蛋白的分比在增加。诱导后0h，1h，2h，3h，4h，4.5h，5h，6h，6.5h，融合蛋白的表达分别为1.7726%，1.4991%，29.213%，34.531%，35.135%，35.989%，35.696%，35.62%，28.939%。7h时的样品因为中途染菌，所测数据不准确，予以舍弃。从数据变化中，可以看出乳糖诱导在4小时后就超过35%，5h时最大值，接近36%。表达量较高。在此后的发酵中，都采用诱导5h终止发酵并收菌。4.1.3菌体发酵诱导前生长时间的确定Fig5Thegrowthcurvebeforereducing从上图中，可以看出菌种生长3小时时最适合表达。4.1.4Fig6Thefermentablecurveunderreducingcodition结论：从上图中，可以看出在发酵罐中，诱导时间为5小时时吸光度达到最大值。因此，在未加任何补料的情况下，诱导5小时即可收菌。4.2酸水解4.2.2二次酸水解可行性摸索结果12345678910fusionproteinsfusionpartnertargetpeptide

Fig7SDSanalysisoftheacidhydrolysiscondition.（48℃，50mMLane1-5依次分别为0h，5h，18h，20.5h，30h时酸水解液；Lane6融合伙伴等电点沉淀时沉淀溶解液；Lane7上样前调近中性时样品液；Lane8上样前透析袋中沉淀溶解液；Lane9穿透峰；Lane10，透析后的样品峰；从lane1-5可以看出，在酸水解过程中，随着水解时间的延长，融合蛋白量不断减少，融合伙伴和目的小肽量不断增加。水解结束后，调节pH至融合伙伴等电点，离心，沉淀融合伙伴。从lane6可看出，部分目的小肽和融合蛋白夹杂在融合伙伴中共同沉淀下来。除去融合伙伴后，调节pH与洗脱液一致，近中性（pH在6.5-7.0），再用透析袋透析一天左右。透析袋中留有沉淀。对样液和沉淀分析，在lane7，8中可看出，样液中有大量目的小肽，但沉淀中也留有定量目的小肽和融合蛋白。上柱进行离子交换后，对穿透峰lane9，样品峰lane10分析，穿透中无目的小肽，样品峰只有一条带，证明目的小肽达到了电泳纯。综上，可以推断，将调至融合伙伴等电点离心下来的沉淀和透析后沉淀集中处理，可进行二次酸水解，充分利用沉淀融合蛋白和目的小肽，最终提高目的小肽得率。4.2.1酸水解条件摸索结果12345678910fusionproteinsfusionpartnertargetpeptideFig8SDSanalysisoftheacidhydrolysiscondition.(温度，水解时间，盐酸浓度，蛋白含量)Lane1：condition(53℃，0h，100mM，8.5%);lane2：condition(53℃，25h，100mM，8.5%);lane3：condition(38℃，35h，85mM，4.5%);lane4：condition(63℃(43℃，0h，55mM，10.5%);lane6：condition(43℃，20h，55mM，10.5%);lane7：condition(58℃，0h，70mM，0.5%);lane8：condition(58℃，45h，70mM，0.5%);lane9：condition(48℃，0h，25mM，2.5%);12345678910fusionproteinsfusionpartnertargetpeptide

Fig9SDSanalysisoftheacidhydrolysiscondition.(温度，水解时间，盐酸浓度，蛋白含量)Lane1：condition(58℃，45h，70mM，0.5%);Lane2：condition(58℃，0h，70mM，0.5%);Lane3：condition(53℃，0h，100mM，8.5%);Lane4：condition(53℃，25h，100mM，8.5%);Lane5：condition(48℃，40h，25mM，2.5%);Lane6：condition(48℃，0h，25mM，210.5%);Lane8：condition(43℃，0h，550mM，2.5%);Lane9：condition(38℃，35h，85mM，4.5%);Lane10：condition(38℃，0h扫描电泳图，获得下述结果—table4。Group\FactorTime，hrTemp，℃[HCl]，mMFusionpro.PercentFusionpro.unhydrolysispercent120435510.55.94225531008.50.31433063406.5050505\7506811512.5\对比组30485050.0529table4由于第6，7组样液较稀，上样量大20μl仍无法在胶体上看出条带。于是无法确定这两组的融合蛋白未水解率，无法使用均匀设计软件计算出最佳酸水解条件。从另一个角度上看，由于该样品随着水解温度的升高，融合蛋白会发生非特异性水解反应，在胶带上体现出目的小肽斑点增大，融合伙伴斑点反而减小的情况。原因是在目的小肽中可能含有一部分非特异性水解产物。对第6，7组而言，即使通过扫描算出来结果，也可能无法体现真正的酸水解条件。因此，此次酸水解条件摸索失败，本实验中酸水解条件仍为（30h，48℃，50mM，5%应重新设定酸水解温度范围，保证最高温度不要超过50℃，尽量避免非特异性水解反应，重新实验。4.3柱层析4.3.1检测波长在210nm-290nm处的吸光度变化Fig10结论1：从上图中可以看出在210nm-290nm间，目的小肽在210nm处的吸光度最大，且较280nm处吸光度大很多。4.3.2检测峰在210nm-280nm处峰型的比较透析后直接上样情况

Fig11

Fig12透析后280nm处检测结论2：从Fig11，Fig12两图中，可以看出样品透析直接上样后进行离子交换，在210nm处和280nm处产生的时间-吸光度曲线峰型基本相同。从结论1又可知，在210nm处吸光度远大于280nm处。故210nm比280nm处检测更可靠、更灵敏。透析后乙酸铵稀释上样情况

Fig13乙酸铵稀释上样210nm处检测

Fig14乙酸铵稀释上样280nm处检测结论3：从Fig13，Fig14两图中，可以看出样品透析后乙酸铵稀释上样后进行离子交换，在210nm处和280nm处产生的时间-吸光度曲线峰型基本相同。从结论1又可知，在210nm处吸光度远大于280nm处。故210nm比280nm处检测更可靠、更灵敏。透析后水稀释上样情况Fig15透析后水稀释上样210nm处检测

↓↓↓↓↓峰123样品峰高盐峰Fig16透析后水稀释上样280nm处检测

fig17lane1-7：高盐峰，PTH样品峰，峰1，峰2，峰3，柱层析前，PTH结论4：从Fig15，Fig16两图中可以看出样品透析后水稀释上样后进行离子交换，在210nm处和280nm处产生的时间-吸光度曲线峰型基本相同。210nm处峰型成“梯度”，估计是因为在使用样品自动收集器时出现了意外，每管收集不均匀，致使图形有些偏差。结论5：从Fig16及Fig17图可看出，用水稀释上样，样品峰一条带，达到了电泳纯，峰1，3，及高盐峰均无目的肽出现，峰2隐约可见有目的肽，为此，可考虑用水稀释上样或用水透析上样，降低平衡的盐离子的浓度，增大梯度洗脱的范围，以求目的肽在梯度范围内洗脱出来，这样可减少乙酸铵的用量，降低成本。透析后水稀释上样情况Fig18注：此图为6月7日在获得三波长（220nm，260nm，280nm）核酸蛋白检测仪的情况下所测的柱层析图谱。虽然在220nm处检测的并不是完全符合我们需要的210nm的峰型和吸光度，但是此图反映了在不同波长情况下检测峰，峰型不发生改变。又从Fig10综上，可确定在210nm处检测，更灵敏、更可靠。讨论与心得5.1本实验是在前人工作基础上完成的。接手本实验时，已拥有能正确表达含有Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro的融合蛋白的大肠杆菌。因此，本人主要摸索工作从发酵和表达开始。而且由于人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究这一课题由我跟邢浩同学共同完成，他主要负责摸索融合蛋白的分离纯化的改进，本人的主要工作是目的小肽的分的分离纯化的改进。于是的本人的工作就在摸索了发酵和表达这一步骤后，直接跳到了酸水解，然后进行柱层析。发酵和表达：从LB培养基过渡到玉米培养基的选择，其主要考虑因素是经济实惠，适合工业应用。在发酵过程中，对菌体生长时间的控制和最佳诱导时间的控制，还需再进行重复性实验，才能予以确定。因为在发酵罐中，接种量的多少、溶氧大小、转速高低、pH值的变化与培养时间、诱导时间一样都会影响到融合蛋白的表达。接种量、溶氧、转速、pH值在各次发酵中的不稳定，会使得所测的菌体生长时间和诱导时间不同。因此只有多次发酵实践探索，才能寻找到一组最佳发酵条件。另外，在大发酵罐中，由于生长条件适宜，菌体短时间内大量繁殖，造成诱导后菌体数目过多，营养条件匮乏，使pH值上升。pH值上升到一定程度后，微生物将发生自溶现象。因此，在自动发酵罐中进行高密度发酵时，可在发酵过程中直接加酸/碱或补料，使微生物始终在适宜的，营养丰富的条件下生长、繁殖，大量合成需要表达的融合蛋白。本人由于时间有限，没有进一步摸索发酵最佳条件及和酸/碱或补料添加量。酸水解：酸水解条件的摸索采用均匀设计法定出各实验点条件，逐一进行实验，寻求最适条件，这个思路没有问题。但目的小肽在剧烈条件下，Asp-X(X≠Pro)也会断裂。而hPTH（1-34）的第30位即为Asp。在本人的实验电泳图中可以看出，温度越高，保温时间越长，目的小肽的斑点越大，但融合伙伴的斑点有消失的趋势，而且目的小肽斑点中很有可能有一部分是非特异性水解产物Pro-Pro-hPTH（1-30）。本人最大的失误是将水解温度上限定的太高，定到了68℃，但实际操作中发现，当温度上到50参考文献王春晓.两种新型人甲状旁腺素活性片段类似物研究[D].南京：中国药科大学生命科学与技术学院，2021.陆静宁.重组人甲状旁腺素肽的生产工艺及其质量研究.南京：中国药科大学，2021，6（4）PottsJrJT，KronenbergHM，RosenblallM.Parathyroidhormone：chemistry，Biosynthesis，andmodeofchain[J].AdvProteinChem，1982，35：323王春晓，刘景晶.HPTH(1-34)及hPTHrP(1-34)的结构与功能的关系[J].药物生物技术，2021，10（6）：394-400Nishida，YamaguchiA，TanizawaT，etal.Increasedboneformationbyintermittentparathyroidhormoneadministrationisduetothestimulationofosteoprogenitorcellsinbonemarrow[J].Bone，1994，15(6)：717-723KentmaooHT，SauerMM，HendyGN，etal.CompleteaminoacidsequenceofHumanparathyroidhormone[J].Biochemistry，1978，17：5723TregearGW，VanRietschotenJ，GreeneE，etal.Bovineparathyroidhormone：Minimumchainlengthofsyntheticpeptiderequireforbiologicalactivity[J].Endocrinology，1973，93：1349WallsKJ，SzaboAG.Conformationofparathyroidhormone：Time-resolvedFluorescencestudies[J].Biochemistry，1992，31(37)：8924BanlenJ，RnthMC.StabilizedNMRstructureofhumanparathyroidhormone(1-34)[J].EurJBiochem，1993，215：315韩志岩，程锦轩.甲状旁腺激素治疗骨质疏松研究进展[J].中国药理学通报，2021，13（5）：397AndrewSaxeMD.Preathyroidtransplantation：areview[J].Srurgery，1984，95：50712．倪国华.凝胶过滤分离鸡肉蛋白酶解物时紫外检测波长的选择.食品研究与开发，2021，10.致谢本论文的完成得到了李泰明老师及庄志华师姐的帮助。在实习过程中，她们在实验方法及实验设计上对我的指导，使我获益匪浅，同时在生活上也给了我极大的关怀，在此表示衷心的感谢和深深的敬意！此外，我还要由衷的感谢酶工程实验室的每一位老师和师兄师姐给予我的莫大的帮助和教诲。最后，衷心的祝愿各位老师和师兄师姐工作顺利，学业进步，开心每一天！

咖啡店创业计划书第一部分：背景在中国，人们越来越爱喝咖啡。随之而来的咖啡文化充满生活的每个时刻。无论在家里、还是在办公室或各种社交场合，人们都在品着咖啡。咖啡逐渐与时尚、现代生活联系在一齐。遍布各地的咖啡屋成为人们交谈、听音乐、休息的好地方，咖啡丰富着我们的生活，也缩短了你我之间的距离，咖啡逐渐发展为一种文化。随着咖啡这一有着悠久历史饮品的广为人知，咖啡正在被越来越多的中国人所理解。第二部分：项目介绍第三部分：创业优势目前大学校园的这片市场还是空白，竞争压力小。而且前期投资也不是很高，此刻国家鼓励大学生毕业后自主创业，有一系列的优惠政策以及贷款支持。再者大学生往往对未来充满期望，他们有着年轻的血液、蓬勃的朝气，以及初生牛犊不怕虎的精神，而这些都是一个创业者就应具备的素质。大学生在学校里学到了很多理论性的东西，有着较高层次的技术优势，现代大学生有创新精神，有对传统观念和传统行业挑战的信心和欲望，而这种创新精神也往往造就了大学生创业的动力源泉，成为成功创业的精神基础。大学生创业的最大好处在于能提高自己的潜力、增长经验，以及学以致用;最大的诱人之处是透过成功创业，能够实现自己的理想，证明自己的价值。第四部分：预算1、咖啡店店面费用咖啡店店面是租赁建筑物。与建筑物业主经过协商，以合同形式达成房屋租赁协议。协议资料包括房屋地址、面积、结构、使用年限、租赁费用、支付费用方法等。租赁的优点是投资少、回收期限短。预算10-15平米店面，启动费用大约在9-12万元。2、装修设计费用咖啡店的满座率、桌面的周转率以及气候、节日等因素对收益影响较大。咖啡馆的消费却相对较高，主要针对的也是学生人群，咖啡店布局、格调及采用何种材料和咖啡店效果图、平面图、施工图的设计费用，大约6000元左右3、装修、装饰费用具体费用包括以下几种。(1)外墙装饰费用。包括招牌、墙面、装饰费用。(2)店内装修费用。包括天花板、油漆、装饰费用，木工、等费用。(3)其他装修材料的费用。玻璃、地板、灯具、人工费用也应计算在内。整体预算按标准装修费用为360元/平米，装修费用共360*15=5400元。4、设备设施购买费用具体设备主要有以下种类。(1)沙发、桌、椅、货架。共计2250元(2)音响系统。共计450(3)吧台所用的烹饪设备、储存设备、洗涤设备、加工保温设备。共计600(4)产品制造使用所需的吧台、咖啡杯、冲茶器、各种小碟等。共计300净水机，采用美的品牌，这种净水器每一天能生产12l纯净水，每一天销售咖啡及其他饮料100至200杯，价格大约在人民币1200元上下。咖啡机，咖啡机选取的是电控