聚合物在生物高分子分离中的应用

２．聚合物在蛋白质分离中的应用蛋白质是由氨基酸通过酰胺键连接而成的高分子，两性，存在等电点，因其空间结构的复杂性，有亲水或疏水之分。第一页，共二十三页。第二页，共二十三页。第三页，共二十三页。蛋白质在低于等电点时会带上正电荷，在高于等电点时带负电荷．若缓冲溶液的pH值低于蛋白质等电点，蛋白质则吸附H＋而带正电荷，由于静电相互作用，蛋白质与管壁发生吸附。第四页，共二十三页。（a）碱性蛋白质（pI＝8）所带电荷量随pH的变化曲线；（b）在pH＝4时，碱性蛋白质（pI＝8）与毛细管壁发生吸附第五页，共二十三页。１.极端pH值法

pH高于蛋白质的pI时，毛细管内壁对蛋白质产生静电排斥抑制吸附，但是，蛋白质存在的自然状态为pH4－10，高pH如11.0时，容易使蛋白质变性或者水解。pH小于1.5（熔融硅或石英的等电点）时，蛋白质的质子化导致其质荷比差别较小，分辨率难以提高。对等电点相近的蛋白质不易实现分离。一般认为，使蛋白质混合物分离的首选pH值应和蛋白质混合物的pKa值基本一致。McManigillD.AnalChem,1986，58：166～170.第六页，共二十三页。2.添加小分子添加剂表面活性剂：季铵盐和氟化的阳离子表面活性剂。中性盐：如磷酸盐，硫酸钾等。胺类：三乙醇胺、三乙胺、N-乙基二乙醇胺，N,N,N’,N’-四甲基-1,3-丁二胺（TMBD）等。有机溶剂：醇类、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜等，其中最常用的是甲醇和乙腈。选用极端pH值或添加小分子添加剂的方法虽然能从一定程度上降低蛋白质吸附，但是容易导致蛋白质聚集和变性。目前最常用的方法是用聚合物对毛细管内壁进行改性处理。何金兰等.高效毛细管电泳.北京：科学出版社，1996,72～75.VerzolaB,GelfiC,RighettiPG.JChromatogrA，2000，868：85～99.CorradiniD,CannarsaG,FabbriE,etal.JChromatogrA，1995，709：127～134.CorradiniD,CannarsaG.Electrophoresis，1995，16：630～635.第七页，共二十三页。３.聚合物涂覆毛细管内壁抑制

蛋白质吸附

(1)化学键合的毛细管涂层化学键合的交联的PVA涂层对4种碱性蛋白质实现第2次和第902次分离的电泳图谱样品浓度：50ug/mL的（1）细胞色素C，（2）溶解酵素，（3）胰蛋白酶原，（4）胰凝乳蛋白酶原。分离条件：毛细管，内径50μm，总长48.5cm（有效长度40cm）；注入，3kV,5s；缓冲液，40mM磷酸钠；分离，309V/cm第八页，共二十三页。(2)物理吸附的毛细管涂层目前使用的聚合物：中性的聚合物－已经广泛用于DNA和其它一些生物大分子的分析，但是由于蛋白质的吸附作用，使得对蛋白质的分析仍有一定难度。亲水性的聚合物－如甲基纤维素，聚糖等不能很好的吸附在管壁上，稳定性差。带疏水基团的聚合物－聚乙烯基吡咯烷酮，聚N,N-二甲基丙烯酰胺可以形成稳定的涂层，但是由于疏水基团与蛋白质之间的相互作用使得分离效率下降。MadabhushiRS.Electrophoresis，1998，19：224～230.VerzolaB,GelfiC,RighettiPG.JChromatogrA，2000，874：293～303.第九页，共二十三页。羟乙基纤维素的改性

Formationofthecat-HEC

Schematicdiagramofadsorptionofcat-HEContosilicasurface.(1)Cat-HECNo.HEC(g)Glycidyltrimethylamminiumchloride(g)Viscosity(mp.s)Nitrogencontent(%)Cat-HEC-110.02.53800.8Cat-HEC-210.05.03751.3Cat-HEC-310.07.53701.7PreparationandpropertiesofCat-HEC第十页，共二十三页。ElectroosmoticflowasafunctionofpH.Comparisonbetweenabarefused-silicacapillary,HECandcat-HECcoatedcapillary

Electropherogramsofamixtureofstandardproteins.Separationswerecarriedoutusingcat-HEC-2coatedcapillary1=Lysozyme;2=CytochromeC;3=RibonucleaseA.ElectropherogramsofamixtureofstandardproteinsatpH4.6.第十一页，共二十三页。ProteinBarecapillaryN(plate/m)bHECN(plate/m)RSD(%)Cat-HEC-2N(plate/m)RSD(%)CytochromeC93001040003.521860000.86Lysozyme--1620002.452650000.85RibonucleaseA173001800003.562820000.96Electrophoresis,

2008,29,1460-1466.ElectropherogramsofamixtureofstandardproteinsindifferentpH.Separationswerecarriedoutusingcat-HEC-2coatedcapillary1=Lysozyme;2=CytochromeC;3=RibonucleaseA.Migration

timereproducibility(n=3)andpeakefficiencyofproteinsseparatedinpolymer-coatedcapillariesatpH4.6第十二页，共二十三页。(２)HEC-g-P4VPFormationoftheHEC-g-P4VPElectroosmoticflowasafunctionofpH.Comparisonbetweenabarefused-silicacapillary,HECandHEC-g-P4VPcoatedcapillaryElectropherogramsofamixtureofstandardproteins.Separationswerecarriedoutusingcat-HEC-g-P4VPcoatedcapillary.1=Lysozyme;2=CytochromeC;3=RibonucleaseA.第十三页，共二十三页。２．结构规整的聚合物PEO-b-P4VPNOOBrOOOONN+BrsamplesMn

1HNMRa)(×10-4)Mn，GPCb)(×10-4)Mw/Mn(GPC)PEO113-b-P4VP450.971.41.21PEO113-b-P4VP901.442.01.29PEO113-b-P4VP1131.692.41.26PEO113-b-P4VP2943.595.21.35a.MnofPEO-b-P4VPestimatedby1HNMR；b.MnofPEO-b-P4VPdeterminedbyGPC.FormationofthePEO-b-P4VP

1HNMRandGPCdataofPEO-b-P4VPcopolymers第十四页，共二十三页。

EffectofmolecularweightofP4VPblockontheseparationofbasicproteinsatpH4.6.1,lysozyme;2,cytochromec;3,ribonuclease.(A)Typical

TEMimagesof(a)PEO113-b-P4VP45,(b)PEO113-b-P4VP90,(c)PEO113-b-P4VP113,and(d)PEO113-b-P4VP294;(B)Schematicillustrationofcopolymersofdifferentmorphologiescapillarycoatingprocedure(a)PEO113-b-P4VP45,(b)PEO113-b-P4VP90,(c)PEO113-b-P4VP113,and(d)PEO113-b-P4VP294第十五页，共二十三页。

AnalysisofsalivasamplesbyPEO113-b-P4VP294coatedcapillary.Salivasamplesweredilutedto2-foldusingdeionizedwater.Samples(A)withoutand(B)withspikingof0.2mg/mLlysozymewereinjected.Separationconditions:40mMphosphate-citratebuffer,pH5.1;500V/cm;40cmcapillary(30cmtothedetector);temperature25℃.EffectofbufferpHontheseparationofbasicproteins.separationsweretakeninPEO113-b-P4VP294coatedcapillary第十六页，共二十三页。

Electropherogramsofplasmasampleinbarecapillary(A)andaPEO113-b-P4VP294coatedcapillary(B).Separationbuffer:19mMNaOH-Na2B4O7atpH9.7.HSA,humanserumalbumin;α1-AT,α1-antitrypsin;α2-M,α2-macroglobulin;β-lp,β-lipoprotein;Tf,transferrin;IgA,immunoglobulinA;IgG,immunoglobulinG.Electrophoresis2008,29,2812-2819第十七页，共二十三页。

3.多功能分离介质的合成及应用研究(1)HEC-g-PDMA研究背景能进行DNA、蛋白质、氨基酸、同分异构体等的分离SeparationofΦ×174/HaeIIIdigestbyCEwithHEC-g-PDMAat(a)1.0%w/v;(b)1.5%w/v;(c)2.0%w/vEffectofpHvaluesonseparationsofbasicproteinsusingHEC-g-PDMAcoatedcapillary.1,lysozyme;2,cytochromec;3,ribonucleaseA.Electrophoresis,

2008,29,4351–4354.第十八页，共二十三页。

(2)quasi-interpenetratingnetworkofLPAandPDMA

Propertiesofquasi-IPNcontainingLPAwithdifferentmolecularmassesPolymerMvofLPA(MDa)IntrinsicviscosityofLPA(mL/g)MolarratioofAM/DMAIntrinsicviscosityofIPN(mL/g)quasi-IPN-10.2510618.6:188quasi-IPN-20.251065.1:1145quasi-IPN-30.471686.8:1167quasi-IPN-40.471682.6:1266quasi-IPN-50.922786.5:1260quasi-IPN-64.609288.4:1840

EOFasafunctionofpH.Electropherogramsofamixtureofstandardproteins.第十九页，共二十三页。

SeparationofΦ×174/HaeIIIdigestbyCEwithquasi-IPN-3at(a)2%w/v;(b)3%w/v;(c)4%w/v;(d)4%w/v.Conditions:Separationelectricfieldstrengthof(a),(b),and(c)is–6kV,separationelec