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文档简介
ICS65.020.01B16山东省地DB37方标准DBT3987—2020DetectionandidentificationofErwiniacypripedii山东省市场监督管理局发布前言GBT。青岛海关提出、归口并组织实施。。。田间观察检测兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法等检测鉴定方法。腐病菌的检测鉴定及该病害的田间调查与监测。花细菌性褐腐病菌基本信息Bacterialsoftrotoforchid菌目Enterobacteriales，肠杆菌科Enterobacteriaceae，欧文氏菌属Erwinia。理行分离培养及致病性测定。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备及用具解剖刀、玻璃棒、接种环、镊子、培养皿、酒精灯、三角烧瓶、量筒、离心管、滤纸等。4.2主要试剂1000mL，121℃高压灭菌15min。参照附录A中的症状描述观察植株是否有兰花细菌性褐腐病的典型症状，对出现典型症状或可疑症室检测L样品制备病叶上的病健交界部位(无症状样品，随机选取叶片)组织置于培养皿内，用75%的乙醇(或1%的次氯酸钠)表面消毒50s~60s，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中，加适量无菌水，用灭菌玻棒或剪刀捣碎组织，静置15min~20min后，即制成组织悬浮液，用于分离培养及分子生物学检测。Z分子生物检测ZL模板制备对于叶片等植株样品，以已知带菌的兰花植株组织作阳性对照(若无已知带菌材料，可用模拟带菌it分离培养鉴定定。g致病性测定样品及检测结果保存1样品及菌种保存2结果记录与资料保存A(资料性附录)资料A.1症状ipediiediiA.2地理分布A.3寄主植物AeridisjaponiumCypripediumspp)、兜兰属(Paphiopedilum)、蝶兰A.4病原菌形态及理化特征病原菌菌体杆状，两端钝圆，大小为(0.5~1)μmx(1~3)μm，周生鞭毛。光滑不透明。Erwinia属内在兰花上引起腐烂症状的细菌共有三个近似种，分别是E.cypripedii、aE.cypripediiE.chrysanthemiE.carotovora革兰氏染色(24h)----+--++苯基丙氨酸脱氨酶(24h)+--明胶水解(22℃)-++----d++-d-+++-+-+-接触酶反应(24h)+++注：-：0%~10%阳性；d：26%~75%阳性；+：90%~100%阳性(规范性附录)B测引物EcUP：5'-TCAACGCCAAGCCGATTTCT-3'EcNP：5'-ACGAATGAACCGTCGTCGGC-3'BPCR体系及条件L。B脂糖凝胶电泳的DNA条带，并拍摄记录。扩增产物片段大小为420bp。B果判断bpbp条带，仅阳性对照出现420bp条带，PCR扩增结果判定为阴性。参考文献gPrintedinGreatBritain[J].Microbiology,2002,148:583–595.yoforchidhosttiss
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