分子遗传图谱构建课件

第三章分子图谱的构建分子图谱构建的步骤：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍生系；测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。第一节作图群体的建立

要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群体。建立作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体大小的确定等。二、分离群体类型的选择

根据其遗传稳定性可将分离群体分成两大类：一类称为暂时性分离群体，如F2、F3、F4、BC、三交群体等，这类群体中分离单位是个体，一经自交或近交其遗传组成就会发生变化，无法永久使用。另一类称为永久性分离群体，如RI、DH群体等，这类群体中分离单位是株系，不同株系之间存在基因型的差异，而株系内个体间的基因型是相同且纯合的，是自交不分离的。这类群体可通过自交或近交繁殖后代，而不会改变群体的遗传组成，可以永久使用。（一）F2代群体优点：自花授粉植物，还是异花授粉植物，建立F2群体都是容易的。缺点：存在杂合基因型。对于显性标记，将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型。由于这种基因型信息简并现象的存在，会降低作图的精度。为了提高精度，减小误差，则必须使用较大的群体，从而会增加DNA标记分析的费用。不易长期保存，有性繁殖一代后，群体的遗传结构就会发生变化。（二）BC1群体优点：BC1群体中每一分离的基因座只有两种基因型，它直接反映了F1代配子的分离比例。可以用来检验雌、雄配子在基因间的重组率上是否存在差异。缺点：不能长期保存。对于一些人工杂交比较困难的植物，BC1群体也不太合适，因为一是难以建立较大的BC1群体，二是容易出现假杂种，造成作图的误差。（三）RI群体RI（重组自交系）群体是杂种后代经过多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2代开始，采用单粒传的方法来建立。优点：可以长期使用，可以进行重复试验。

缺点：构建RI群体要花费很长时间异花授粉植物由于存在自交衰退和不结实现象，建立RI群体也比较困难。缺点：有些植物的花药培养非常困难，就无法通过花培来建立DH群体。植物的花培能力跟基因型关系较大，因而花培过程会对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏DH群体的遗传结构，造成较严重的偏分离现象，这会影响遗传作图的准确性。

三、群体大小的确定

遗传图谱的分辨率和精度，很大程度上取决于群体大小。群体越大，则作图精度越高。但群体太大，不仅增大实验工作量，而且增加费用。因此确定合适的群体大小是十分必要的。一，合适群体大小的确定与作图的内容有关。

从作图效率考虑，作图群体所需样本容量的大小取决于以下两个方面：是从随机分离结果可以辨别的最大图距。是两个标记间可以检测到重组的最小图距。二，作图群体大小还取决于所用群体的类型。在分子标记连锁图的构建方面，为了达到彼此相当的作图精度，所需的群体大小的顺序为F2>RI>BC1和DH。二、基因重组和连锁理论连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换与重组。基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗传过程中一般倾向于维系在一起。基因的重组是通过一对同源染色体的两个非姊妹染色单体之间的交换来实现的。假设某一对同源染色体上存在Sh-sh，C-c两对连锁基因，现有两个亲本P1和P2，它们的基因型分别为ShShCC和shshcc，两亲本杂交产生ShshCc双杂合体。F1在减数分裂过程中应产生4种类型的配子，其中两种为亲型配子ShC和shc，两种为重组型配子Shc和shC。由于Sh-sh和C-c位于同一染色体上，要产生重组型配子必须在这两个基因的连锁区段上发生交换。

ShCshc二分体ShCShCShCShCShCshcshcshcshcshcshCShcCShCShCShcShCshcshcshcsh四分体全部亲组合占94％3％亲组合3％重组合6%细胞交换F1新新新shcshcShCShCP1P294％细胞无交换三、图谱制作的统计学原理（一）两点测验如果两个基因座位于同一染色体上且相距较近，则在分离后代中通常表现为连锁遗传。对两个基因座之间的连锁关系进行检测，称为两点测验。

了解各基因座位的等位基因分离是否符合孟德尔分离比例，这是连锁检验的前提：在共显性条件下，F2群体中一个座位上的基因型分离比例为1:2:1，而BC1和DH群体中分离比例均为1:1；在显性条件下，F2群体中分离比例为3:1，而BC1和DH群体中分离比例仍为1:1。检验DNA标记的分离是否偏离孟德尔比例，一般采用2检验。两个连锁座位不同基因型出现的频率是估算重组值的基础：在一般的遗传学教材中，重组值的估计是根据分离群体中重组型个体占总个体的比例来估计的。这种估计方法无法得到估计值的标准误，因而无法对估值进行显著性检验和置信区间估计。采用最大似然法进行重组率的估计可解决这一问题。最大似然法以满足其估计值在观察结果中出现的概率最大为条件。在人类遗传学研究中，由于通常不知道父母的基因型或父母中标记基因的连锁相是相斥还是相引，因而无法简单地通过计算重组体出现的频率来进行连锁分析，而必须通过适当的统计模型来估算重组率，并采用似然比检验的方法来推断连锁是否存在，即比较假设两座位间存在连锁（r<0.5）的概率与假设没有连锁（r=0.5）的概率。这两种概率之比可以用似然比统计量来表示，即L（r）/L（0.5），其中L（）为似然函数。为了计算方便，常将L（r）/L（0.5）取以10为底的对数，称为LOD值。要确定两对基因之间存在连锁，一般要求似然比大于1000:1，即LOD>3；要否定两对基因连锁的存在，则要求似然比小于100:1，即LOD<2。在其它生物遗传图谱的构建中，似然比的概念也用来反映重组率估值的可靠性程度或作为连锁是否真实存在的一种判断尺度。（三）交换干扰与作图函数随着间距的增加，两个基因座之间便可能在两处同时发生遗传物质的交换，即双交换。在染色体某区段上发生的双交换，其实际频率往往少于由单交换概率相乘所估得的理论值。这是因为一个位置上所发生的交换会减少其周围另一个单交换的发生，这种现象称为交叉干扰。干扰的程度可用符合系数C表示，符合系数C为实际双交换值与理论双交换值的比值。

理论双交换值是指两个相邻的单交换同时独立发生的概率。其中r1和r2分别为两个相邻染色体区段发生单交换的概率。符合系数C的值变动于0~1之间。当C=0时，表示完全干扰，没有双交换发生；当C=1时，表示没有干扰，两单交换独立发生。一般而言，两单交换的位置相距越远，则彼此干扰的程度就越低，符合系数就越大。作图函数：要计算两个相距较远的基因座之间的图距时，如果中间没有其它基因座可利用，则两个基因座之间实际发生的双交换就不能被鉴别出来，因此，采用一些数学方法进行矫正是必要的，否则，从重组率估计出的图距就会比真实图距小。这种矫正可通过作图函数来实现。

1，在C=1的假定下，图距x与重组率r之间的关系服从Haldane作图函数：x=-（1/2）ln（1-2r）其中x以M为单位。这里M读作Morgan（摩尔根），它是用著名遗传学家摩尔根的姓命名的，并取第一个字母表示1M=100cM（厘摩），1cM为一个遗传单位，即1%的重组率。根据Haldane作图函数，20%的重组率相当于图距为-（1/2）ln（1-2×0.20）=0.255M，即25.5cM。Haldane作图函数的不合理之处在于假定了完全没有交叉干扰。第三节DNA标记分离数据的数学处理

一、分离数据的收集与数字化从分离群体中收集分子标记的分离数据，获得不同个体的DNA多态性信息，是进行遗传连锁分析的第一步。通常各种DNA标记基因型的表现形式是电泳带型，将电泳带型数字化是DNA标记分离数据进行数学处理的关键。

假设某个RFLP座位在两个亲本（P1,P2）中各显示一条带，由于RFLP是共显性的，则F1个体中将表现出两条带，而F2群体中不同个体的带型有三种，即P1型、P2型和F1（杂合体）型。例如，将P1带型记为1，P2带型记为3，F1带型记为2。如果带型模糊不清或由于其它原因使数据缺失，则可记为0。如果存在显性标记，则F2中还会出现两种情况：一种是P1对P2显性，于是P1型和F1型无法区分，这时应将P1型和F1型作为一种类型，记为4。另一种情况正好相反，P2对P1显性，无法区分P2型和F1型，故应将它们合为一种类型，记为5。对于BC1、DH和RI群体，每个分离的基因座都只有两种基因型，不论是共显性标记还是显性标记，两种基因型都可以识别，加上缺失数据的情况，总共只有3种类型。因而用3个数字就可以将标记全部带型数字化。三、构建DNA标记图谱的计算机软件许多学者为构建遗传图谱设计了专用程序包,通过Internet网址可以获得各种专用程序的相关信息，如软件的名称及简要介绍，源程序编码语言、支持的操作系统、执行程序的名称、参考文献以及获取软件的网址等。应用于植物遗传连锁分析和遗传图谱构建的常用软件有LINKAGE、MAPMAKER/EXP等。LINKAGE软件可通过/software/linkage获得，该软件是利用最大似然法估计两座位或多座位间的重组率和LOD值；MAPMAKER/EXP可通过bution/software/mapmaker3获得，该软件可以应用于各种类型的实验群体进行遗传作图，是目前应用最为广泛的作图软件之一。第四节DNA标记连锁图谱的完善一、DNA标记连锁群的染色体定位把分子标记所建立的连锁群与经典遗传图谱联系起来，并将其归属到相应的染色体上，是构建了一个比较饱和的分子图谱之后十分重要的工作。通常根据分子标记与已知染色体位置的形态标记的连锁关系来确定分子标记连锁群属于哪条染色体。还可以利用非整倍体或染色体结构变异材料，如水稻中利用三体、玉米中利用A/B易位系、小麦中利用缺体/四体染色体代换系等，将分子标记连锁群归属到相应的染色体上。

随着技术的进步，原位分子杂交的灵敏度已可以揭示单拷贝序列的杂交位点，因此采用原位分子杂交可以容易地将连锁群的分子标记定位到染色体上。一个完整的遗传图谱，必须知道染色体上的标记与着丝粒之间的距离。一个完整的染色体具有以下几个主要部分：着丝粒、缢痕、随体及端粒。在经典遗传图谱的构建中，一般采用近端着丝粒染色体来对基因与着丝之间的距离进行定位。染色体上的端粒是指染色体的自然末端。近端着丝粒染色体是正常染色体在着丝粒附近断裂形成的异常染色体。在遗传图谱的构建中，端粒位置的确定就意味着为染色体的全长设定界标。传统的凝胶电泳方法由于分辨能力有限，大多数情况下无法将具有多态性的端粒片段区分开来。一般要借助具有高分辨率的脉冲场凝胶电泳（PFGE）才能将有差异的端粒片段分离开来。二、饱和DNA标记连锁图的制作遗传图谱饱和度是指单位长度染色体上已定位的标记数或标记在染色体上的密度。一个基本的染色体连锁框架图大概要求在染色体上的标记平均间隔不大于20cM。

研究了所需标记数与图谱饱和度之间的关系，发现影响所需标记数的主要因素有两个：一个是标记间的平均距离，即图谱总长度除以定位的标记数，它反映了标记图谱的平均密度。另一个因素是标记间的最大距离。通过提高图谱平均密度的方法来缩小最大标记间距是很困难的。在实际研究中，为了填补间隙，应有针对性地在间隙区上寻找标记，或寻找该间隙所在区域上有差异的亲本构建作图群体，利用特性上互补的不同DNA标记进行遗传作图，将有助于提高遗传图谱的饱和度。三、DNA标记连锁图与经典遗传连锁图的整合为了充分利用现有的分子和遗传的信息，必须将分子遗传图谱与经典遗传图谱结合起来，成为一张综合的遗传图谱。将两类遗传标记综合到一张遗传图谱中去，不仅是重要经济性状准确定位的需要，也是以图位克隆方法分离目的基因的需要。分子图谱与经典图谱的整合只能通过将传统的遗传标记基因一个一个地定位到分子图谱中去的策略来进行。为此，可以选择各种传统的遗传标记材料来建立作图群体，并用适当的方法快速地找到与传统的遗传标记紧密连锁的分子标记，再根据分子标记在分子图谱上的位置来确定传统遗传标记的位置。

第五节比较作图

比较作图（ComparativeMapping）就是利用一种物种的DNA标记对另一物种进行遗传或物理作图。比较作图的分子基础就是物种间DNA序列尤其是编码序列的保守性。通过比较作图可揭示不同物种基因组或基因组区域同线性或共线性的存在，从而了解不同物种基因组结构的相似性及基因组进化的历程。同线性是指定位在一个物种的染色体上的两个或多个标记又被定位于另一物种的同源染色体区域上，但这些标记间的相对排列顺序可变化