爱爱医资源-免疫胶乳浊度分析在自动生化分析仪上的应用课件

免疫胶乳浊度分析

在自动生化分析仪上的应用免疫比浊回顾免疫胶乳浊度分析（immunolatexturbidimetry）在生化分析仪上进行测定的有关问题2免疫比浊3免疫检测的基础

抗原抗体间的特异性反应手工操作自动化分析核心—基础经典的免疫沉淀试验通常是在抗原与相应抗体反应的终点判定结果，存在费时、操作繁琐、敏感度低（10～100mg/L）、不能自动化等缺陷。根据沉淀反应时，抗原抗体结合后可使反应系统透光度发生改变，建立了以测定透光度为特征的微量免疫沉淀测定法法，既免疫浊度测定技术。5免疫比浊1967年由Richie首次报告，20世纪70年代逐步完善，80年代初期初步应用临床常规检查。抗原抗体在液相（特殊的缓冲液）中快速结合，形成抗原抗体复合物，反应液出现浊度。6免疫比浊液相中抗原与抗体的反应结果与两者的浓度比例有关。抗原或抗体显著过量时，都只能生成少量的可溶性免疫复合物，分子极小，不适于免疫比浊法检测。

免疫比浊技术要求溶液中抗体要保持中等过量，此时免疫复合物（immunecomplex，IC）仍是可溶性的。在这种情况下，抗原与抗体的反应遵循质量作用定律（Ag+Ab＝Ag.Ab），形成IC的量是抗原或抗体的函数。当抗体固定时，IC的量与抗原的量成正比。7免疫比浊8LIGHTSOURCEFILTERREACTIONCUVETTETURBIDIMETRICDETECTORNEPHELOMETRICDETECTORIC散射比浊、透射比浊光路图

θ透射光+散射光散光射平光线散射比浊专用仪器专用配套试剂原装进口试剂昂贵透射比浊生化分析仪开放试剂（可用国产试剂）10速率法和终点法测定；速率法的灵敏度和特异性优于终点法；终点法的稳定性较好；透射还是散射目前，由于技术的发展，两种比浊法的灵敏度和特异性已接近，而全自动生化仪的自动化程度和精密度要胜于专用散射比浊仪，透射免疫比浊法在临床上的应用日益广泛。生化分析仪通过免疫比浊法技术，架起了现代生化检验和现代免疫技术的桥梁。免疫化学是免疫学技术和生物化学技术的结合。既具有免疫学抗原抗体结合的特异性，又具有生物化学反应动力学特点。11透射还是散射透射免疫比浊免疫复合物直径为35～lOOnm，这一范围要求近紫外光处入射光发出最大的干扰(最大吸收峰)，选择290～410nm波长测定最佳。由于抗原抗体结合后在短时间内(<19s)只能形成小复合物，无法进行比浊，需要等几分钟到数小时(>19s)形成可见的复合物，才能进行比浊。为了提高复合物形成速度，加入促聚剂，如4％聚乙二醇(MW：6000～8000)，可使复合物形成在3～10min完成。13比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。为解决快速反应及微量化的要求，建立了免疫胶乳浊度法（immunolatexturbidimetry）。14免疫胶乳浊度分析

（immunolatexturbidimetry）其基本原理是：将特异性抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内，不阻碍光线透过；两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少。免疫微球凝聚的程度为被测物浓度的函数，由此可测出标本中待测物的含量。15免疫胶乳浊度分析

（immunolatexturbidimetry）该技术的关键在于两个方面：首先是选择适用的胶乳，其大小（直径）要稍小于波长。用500nm波长者，选择100nm颗粒较适合；用585nm波长者，则选用100～200nm颗粒为好。目前多用200nm的胶乳颗粒。其次，胶乳与抗体结合时用化学交联虽好，但失活也较严重；一般用吸附法即可。17免疫胶乳浊度分析

（immunolatexturbidimetry）18免疫胶乳浊度分析

（immunolatexturbidimetry）胶乳颗粒多为惰性微球和羧基化微球氨基化高分子纳米微球氨基化纳米微球的颗粒大小较传统的微球更小（约0.1μm），它与抗体的结合是通过其表面的氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。与采用惰性纳米微球的传统技术相比，检测的灵敏度得到了极大的改善，最高可达到1.0ng/ml。19免疫胶乳浊度分析

（immunolatexturbidimetry）胶乳比浊分析颗粒增强透射免疫比浊法（particle-enhancedturbidimetricimmunoassay,PETIA）胶乳增强免疫浊度测定（Latexenhancedturbidimetricimmunoassay,LETIA）粒子强化免疫浊度测定21免疫胶乳浊度分析

（immunolatexturbidimetry）22生化仪上开展的免疫项目serumproteins血清蛋白类IgA（免疫球蛋白A）IgG（免疫球蛋白G）IgM（免疫球蛋白M）IgE（免疫球蛋白E）C3（补体C3）C4（补体C4）Microalbumin

（微量白蛋白）2-microglobulin（2球蛋白）-1-acidglycoprotein（-1酸性糖蛋白）Ferritin（铁蛋白）Transferrin（转铁蛋白）

心血管疾病监测ApoA-1（载脂蛋白A1）ApoB（载脂蛋白B）Lp(a)（脂蛋白a）h-CRP(超敏感C反应蛋白）Homocysteine

（同型半胱氨酸）D-Dimer（D二聚体）Myoglobin（肌红蛋白）cTnI（肌钙蛋白I）23生化仪上开展的免疫项目25TDM治疗药物监测Phenobarbital

（苯巴比妥）Phenytoin（苯妥英纳）Valproicacid（丙戊酸）Carbamazepine（卡马西平）Theophylline（茶碱）Gentamicin（庆大霉素）Digoxin（地高辛）Digitoxin（洋地黄）Vitamins维生素VitaminB12

（维生素B12）Folate（叶酸）infectiousDiseases传染性疾病TOXO（弓形体）RUBELLA（风疹病毒）生化仪上开展的免疫项目26免疫比浊法试剂的组成R1（试剂I）:缓冲液R2（试剂

II）:启动试剂

(带或不带乳胶颗粒)STANDARDS（标准液）

(一点或多点标准)CONTROLS（质控液）反应类型（需要乳胶）LATEXPARTICLEAg2930试剂成份的功用缓冲液:使反应有最大限度的敏感性避免非特异的结果降低反应时间启动试剂:产生抗原-抗体反应标准液:建立浓度与信号（吸光度）之间的关系质控液:检查定标的情况CRM470-全新的国际蛋白标准3132CRM欧共体参考局（BCR）的认可参考品。CRM470是14种（血清）蛋白分析物的参考制品。CRM470基于人血清（人血清蛋白参考制备物lot5，RPPHSlot5）的CertifiedReferenceMaterial由以下组织共同发展：

IFCCBCRBrusselsCAPUSA

CRM470-全新的国际蛋白标准33CRM470在欧洲由BCR制备提供。在美国则由美国病理协会（CAP）提供材料。生产厂家用CRM470对自己的定标液和质控液进行标化。CRM和SRM（StandardReferenceMaterial标准参考材料）可以认为是目前可以提供的最高质量的材料。SRM主要用于USA（国家标准和技术研究院NIST）。

CRM470-全新的国际蛋白标准基于CRM470参考物的成人参考范围CRM470参考物及其参考范围血浆蛋白质

每个CRM470的参考范围（g/L）白蛋白 35～52α-1-抗胰蛋白酶 0.9～2.0（α-1-抗胰蛋白酶抑制剂）C3C-补体 0.9～1.8C4-补体 0.1～0.4铜兰蛋白 0.2～0.6C-反应蛋白（CRP）

≤0.005α-1-酸性糖蛋白（类粘蛋白） 0.5～1.2触珠蛋白 0.3～2.0IgA 0.7～4.0IgG 7～16IgM 0.4～2.3α-2-巨球蛋白 1.3～3.0前白蛋白（transthyretin） 0.2～0.4转铁蛋白 2.0～3.6

注：C3C在新鲜样本中可期望较低的参考范围3435对实验室的生化分析仪尽可能充分的掌握并理解。理解各个检测项目的方法学原理。仔细认真阅读商品化试剂的说明书。销售商或者厂家技术部门的支持。“所谓生化分析仪就是将实验参数输入仪器，由仪器按照试验指令来完成整个试验。参数设置，基本功在仪器之外，如果对分析化学、对酶动力学、仪器性能没有一定的掌握，是很难设置好参数的。”在自动生化分析仪上的应用36免疫浊度法在生化分析仪上常见的测定（分析）方式FINALPOINTDFINAL-SAMPLEBLANKD-AFINAL-INITIALD-BKINETIC (C-B)/timeR2(LATEXORANTISERA)SAMPLEANDR1(BUFFER)TIMEODincrement37测定CRP分析方式

采用双试剂、两步终点法37℃5min37℃5minA1A2SampleenR1R2R1R2End38Heidelberger&KendallExperienceExcessantibodyzone

EquivalencezoneExcessantigenzoneAntigenconcentration

TURBIDITY(OD)（usefulzone）ABC免疫浊度测量多点定标依据抗原抗体反应特性，免疫比浊测量选择在A区，IC的浊度随着抗原的增加而增加，但不是呈线性的对应关系（曲线往往有截距或呈S形），要得到正确的结果，必须做一个多点定标的标准曲线。自动生化分析仪多推荐5点或6点定标，然后选择适当的数学模型作曲线拟合，如：Logit-Log变换；y=d+cx+bx2+ax33940多点定标：RF、CRPREALRELATIONANDCURVEOFCALIBRATIONSTRAIGHTLINECALIBRATION(THEREISANERROR)concentrationODincrement41CONCENTRATIONODincrementREALRELATIONSTRAIGHTLINECALIBRATION一点定标：例如ASO免疫浊度测量多点定标校准曲线的选择和拟合效果检验：选择何种校准曲线作数据处理，是试验成功的关键之一。一般用试剂厂家提供的或文献介绍的校准模式。应该对拟合曲线作检验和比较。42带现象（zonephenomenon）的影响抗原或抗体过剩使免疫复合物部分或全部解离的现象，称为带现象。免疫浊度测定中常表现为抗原过剩时免疫复合物形成的量反而下降，又称钩状效应（hookeffect）。克服办