电子传递与氧化磷酸化

电子传递与氧化磷酸化第1页/共155页Cellsneedenergytodoalltheirwork

Togenerateandmaintainitshighlyorderedstructure(biosynthesisofmacromolecules).Togenerateallkindsofmovement.Togenerateconcentrationandelectricalgradientsacrosscellmembranes.Tomaintainabodytemperature.Togeneratelightinsomeanimals.第2页/共155页第3页/共155页Somehistoricalfactsaboutourunderstandingonoxidativephosphorylation

1930s:PyruvatewasknowntobecompletelyoxidizedtoCO2viathecitricacidcycle(withO2consumed).1930s:NAD+andFADwerefoundtobee-carriersbetweenmetabolitesandtherespiratorychain.1930s:RoleofATP

andgeneralimportanceofphosphorylation

inbioenergeticswererealized.第4页/共155页

1950s:Isolated

mitochondriawerefoundtoeffecttheobligatorycouplingofthephosphorylationofADPandthee-transferfromNADHtoO2.1961,thechemiosmotichypothesiswasproposedforlinkingthee-transferandADPphosphorylation(basedontheuncouplingphenomenon

andtheintactnessrequirement)1960s,ATPsynthasewasidentifiedfrommitochondria.第5页/共155页

概念：糖类、脂肪、蛋白质等有机物质在细胞中进行氧化分解生成CO2和H2O并释放出能量的过程称为生物氧化（biologicaloxidation），其实质是需氧细胞在呼吸代谢过程中所进行的一系列氧化还原反应过程，所以又称为细胞氧化或细胞呼吸。生物氧化第6页/共155页

ConceptofBiologicalOxidation

Oxidationofmaterialsinthebiologicalbody

Degradationofglucoses,fattyacids,proteins

Releaseofenergy

FormationofCO2andH2O

TraptheenergyreleasedasATPandBodyheat

第7页/共155页与非生物氧化相比:相同点生物氧化与非生物氧化的比较

化学本质相同，都是失电子反应，如脱氢、加氧、传出电子。失电子者为还原剂，是电子供体，得电子者为氧化剂，是电子受体。在生物体内，生物氧化有三种方式：加氧氧化，电子转移和脱氢氧化。同种物质不论以何种方式氧化，所释放的能量相同。

第8页/共155页Electrontransferviared-oxreactionsgeneratesbiologicalenergyOxidativereaction

De-electron

Dehydrate

AddoxygenReductivereaction

Acceptelectron

Addhydrate

De-oxygen第9页/共155页不同点：

生物氧化是酶促反应，反应条件（如温度、pH）温和；而体外燃烧则是剧烈的游离基反应，要求在高温、高压以及干燥的条件下进行。生物氧化分阶段逐步缓慢地氧化，能量也逐步释放；而体外燃烧能量是爆发式释放出来的。生物氧化释放的能量有相当多的转换成ATP中活跃的化学能，用于各种生命活动；体外燃烧产生的能量则转换为光和热，散失在环境中。第10页/共155页CO2的生成

方式：生物氧化过程中生成的CO2并不是代谢物上的碳原子与吸入的氧直接化合的结果，而是有机酸脱羧作用生成的。糖、脂、蛋白质等有机物转变成含羧基的中间化合物，然后在酶催化下脱羧而生成CO2。

根据所脱羧基在有机酸分子中的位置，可将脱羧反应分为α－脱羧和β－脱羧；又根据反应的同时是否伴有氧化反应，分为单纯脱羧和氧化脱羧。

类型：α-脱羧和β-脱羧（从脱羧的位置）氧化脱羧和单纯脱羧（脱羧方式）第11页/共155页DirectDecarboxylationa-direct

decarboxylationH3CCCOOHOa-酮酸脱羧酶Mg2+

TPPH3CCOH+

CO2第12页/共155页

OxidativeDecarboxylation第13页/共155页H2O的生成

代谢物在脱氢酶催化下脱下的氢由相应的氢载体（NAD+、NADP+、FAD、FMN等）所接受，再通过一系列递氢体或递电子体传递给氧而生成H2O

。CH3CH2OHCH3CHONAD+

NADH+H+乙醇脱氢酶1\2O2NAD+电子传递链

H2O2eO=2H+第14页/共155页脂肪葡萄糖、其它单糖三羧酸循环电子传递（氧化）蛋白质脂肪酸、甘油多糖氨基酸乙酰CoAe-磷酸化+Pi

小分子化合物分解成共同的中间产物（如丙酮酸、乙酰CoA等）

共同中间产物进入三羧酸循环,氧化脱下的氢由电子传递链传递生成H2O，释放出大量能量，其中一部分通过磷酸化储存在ATP中。大分子降解成基本结构单位生物氧化的三个阶段第15页/共155页Biologicaloxidationsarecatalyzedbyintracellularenzymes.Thepurposeofoxidationistoobtainenergy.ElectronTransport:Electronscarriedbyreducedcoenzymes(NADHorFADH2)arepassedsequentiallythroughachainofproteinsandcoenzymes(socalledelectrontransportchain)toO2.OxidativePhosphorylation:Couplinge-Transport(Oxidation)andATPsynthesis(Phosphorylation).

Itallhappensinmitochondrionorattheinnermitochondrialmembrane(eukaryoticcells)第16页/共155页ImpermeabletoionsandmostothercompoundsIninnermembraneknobsthemitochondrioncontainedtheenzymesresponsibleforelectrontransportandoxidativephosphorylation第17页/共155页MitochondriaoutermembranerelativelypermeableinnermembranepermeableonlytothosethingswithspecifictransportersImpermeabletoNADHandFADH2PermeabletopyruvateCompartmentalizationKreb'sandβ-oxidationinmatrixGlycolysisincytosol第18页/共155页MostenergyfromRedoxelectronsduringmetabolicreactionssenttoNADandFADGlycolysisIncytosolproduces2NADHPyruvatedehydrogenasereactionInmitochondrialmatrix2NADH/glucoseKrebsInmitochondrialmatrix6NADHand2FADH2/glucose第19页/共155页线粒体是生物氧化的发生场所第20页/共155页

线粒体基质是呼吸底物氧化的场所，底物在这里氧化所产生的NADH和FADH2将质子和电子转移到内膜的载体上，经过一系列氢载体和电子载体的传递，最后传递给O2生成H2O。这种由载体组成的电子传递系统称电子传递链（eclctrontransferchain),因为其功能和呼吸作用直接相关，亦称为呼吸链。柠檬酸循环在线粒体基质中进行，电子传递和氧化磷酸化在线粒体内膜上进行。电子传递链的概念第21页/共155页ElectronTransportandOxidativePhosphorylationElectrontransportandoxidativephosphorylationre-oxidizeNADHandFADH2andtraptheenergyreleasedasATP.Ineukaryotes,electrontransportandoxidativephosphorylationoccurintheinnermembraneofmitochondriawhereasinprokaryotestheprocessoccursintheplasmamembrane.第22页/共155页电子传递链的组成

呼吸电子传递链主要由蛋白质复合体组成，在线粒体内膜上有4种参与电子传递的蛋白质复合体，分别为

NADH－Q还原酶（NADH-Qreductase）琥珀酸－Q还原酶（succinate-Qreductase）细胞色素还原酶（cytochromereductase）细胞色素氧化酶（cytochromeoxidase）第23页/共155页洋地黄皂苷第24页/共155页Variousprostheticgroupsactasintermediateelectroncarriersintherespiratorychain第25页/共155页第26页/共155页呼吸链的组成1.黄素蛋白酶类（flavoproteins,FP）2.

铁-硫蛋白类（iron—sulfurproteins)3.辅酶Ｑ（ubiquinone,亦写作CoQ）4.细胞色素类（cytochromes）5.血红素

(hemes)6.铜离子（Cu＋）NADH辅酶Q（CoQ）Fe-SCytc1O2CytbCytcCytaa3琥珀酸等黄素蛋白（FAD）黄素蛋白（FMN）细胞色素类铁硫蛋白（Fe-S）铁硫蛋白（Fe-S）第27页/共155页电子传递的方向

在电子传递链中，有一系列电子传递体，这些电子传递体的排列顺序是根据它们的电极电位决定的。呼吸链中的电子传递有着严格的方向和顺序，即电子从氧化还原电位较低的传递体依次通过氧化还原电位较高的传递体逐步流向氧分子。第28页/共155页ElectronsofNADHandFADH2aretransferredtoO2viamanyintermediateelectroncarriersontheway第29页/共155页第30页/共155页NADH呼吸链NADHFMNCoQFe-SCytc1O2CytbCytcCytaa3Fe-SFADFe-S琥珀酸等复合物Ⅱ复合物Ⅳ复合体I复合物ⅢNADH脱氢酶细胞色素还原酶细胞色素氧化酶琥珀酸-辅酶Q还原酶FADH2呼吸链第31页/共155页NADH呼吸链电子传递和水的生成H2O12O2O2-MH2还原型代谢底物FMNFMNH2CoQH2CoQNAD+NADH+H+2Fe2+2Fe3+

细胞色素b-c-c1-aa3

FeS2H+M氧化型代谢底物FADH2呼吸链电子传递和水的生成2eH2OFADFADH2琥珀酸

FeS2Fe2+2Fe3+

细胞色素b-c1-c-aa3CoQH2CoQ12O2O2-2H+延胡索酸2e第32页/共155页电子传递链各个成员1.NADH－Q还原酶

NADH－Q还原酶又称为NADH脱氢酶，简称为复合体Ⅰ。该酶含有FMN辅基和Fe-S聚簇，催化反应时，先将NADH的电子传递到FMN上，再传给Fe-S聚簇，最后传给辅酶Q。Fe-S聚簇有几种类型，含有Fe-S聚簇的蛋白质称为铁硫蛋白，又称为非血红素铁蛋白。Fe-S聚簇通过其中的Fe2+和Fe3+的变化来传递电子。第33页/共155页铁硫蛋白(简写为Fe-S)是一种与电子传递有关的蛋白质，它与NADHQ还原酶的其它蛋白质组分结合成复合物形式存在。铁与无机硫原子或是蛋白质肽链上半胱氨酸残基的硫相结合，常见的铁硫蛋白有三种组合方式（a）单个铁原子与4个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。（b）两个铁原子、两个无机硫原子组成（2Fe-2S），其中每个铁原子还各与两个半胱氨酸残基的巯基硫相结合。（c）由4个铁原子与4个无机硫原子相连（4Fe4S），铁与硫相间排列在一个正六面体的8个顶角端；此外4个铁原子还各与一个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。铁硫蛋白中的铁可以呈两价（还原型），也可呈三价（氧化型），由于铁的氧化、还原而达到传递电子作用。第34页/共155页Iron-sulfurcenters(Fe-S)areprostheticgroupscontaining1-4ironatomsIron-sulfurcenterstransferonlyoneelectron,eveniftheycontaintwoormoreironatoms.Iron-sulfurCenters(clusters)第35页/共155页简写为NADHQ还原酶,即复合物I，它的作用是催化NADH的氧化脱氢以及Q的还原。所以它既是一种脱氢酶，也是一种还原酶。它的活性部分含有辅基FMN和铁硫蛋白。FMN的作用是接受脱氢酶脱下来的电子和质子，形成还原型FMNH2。还原型FMNH2可以进一步将电子转移给Q。

NADHQ还原酶

NADH+Q+H+=========NAD++QH2第36页/共155页Complex1HasNADHbindingsiteNADHreductaseactivityNADH-NAD+NADH--->FMN--->FeS--->ubiquinoneubiquinone--->ubiquinoneH24H+pumped/NADH第37页/共155页第38页/共155页2.辅酶Q

辅酶Q(CoenzymeQ)又称泛醌（ubiquinone），有时简称为Q或UQ，是一种脂溶性物质，它可以接受1个电子还原成半醌中间体，再接受1个电子还原成对苯二酚形式。它有一个长长的碳氢侧链，哺乳动物中最常见的是具有10个异戊二烯单位的侧链，简写为Q10，在非哺乳动物中这个侧链可能只有6-8个异戊二烯单位。由于其脂溶性强，可以在线粒体内膜中扩散。第39页/共155页辅酶Q的结构和氧化还原态第40页/共155页3.琥珀酸－Q还原酶

琥珀酸－Q还原酶又称为复合体Ⅱ，完整的此酶包括柠檬酸循环中的琥珀酸脱氢酶，由4条多肽链组成，总的相对分子质量约140×103，含有一个以FAD为辅基的黄素蛋白、2个铁硫蛋白和一个细胞色素b。其作用是催化电子从琥珀酸通过FAD和铁硫蛋白传递到辅酶Q。所以复合物Ⅱ只能传递电子，而不能使质子跨膜输送。第41页/共155页ComplexIIsuccinate---FAD—ubiquinoneContainscoenzymeQFADH2bindingsiteFADreductaseactivityFADH2--FAD第42页/共155页ComplexII:Succinate-coenzymeQreductase第43页/共155页4.细胞色素还原酶

细胞色素还原酶又称复合体Ⅲ、辅酶Q－细胞色素c还原酶。它的作用是将还原型辅酶Q的电子传递给细胞色素c。细胞色素还原酶中含有细胞色素b，也含有2Fe-2S聚簇。

第44页/共155页细胞色素（cytochrome)

细胞色素是一类含有血红素辅基的电子传递蛋白质的总称。因为有红颜色，又广泛存在于生物细胞中，故称为细胞色素。还原型细胞色素具有明显的可见光吸收，可以看到α、β和γ三个吸收峰，其中α峰的波长随细胞色素种类的不同而各有特异的变化，可用来区分不同的细胞色素。氧化型细胞色素在可见光区看不到吸收峰。细胞色素中的血红素有三种，分别称为细胞色素a、b和c，同一种细胞色素血红素因结合的蛋白质不同，其α吸收峰的波长会发生小的变化，如细胞色素还原酶中含有的细胞色素b就分为bH（b562）和bL（b566）两种。第45页/共155页几种细胞色素的最大吸收峰波长/nm细胞色素αβγa600439bL566bH562532429c550521415c1554524418第46页/共155页细胞色素

传递电子机理：

+e+eFe3+Fe2+Cu2+Cu+

－e－e

特点：以血红素为辅基，血红素的主要成份为铁卟啉。类别:

根据吸收光谱分成a、b、c三类，呼吸链中含5种（b、c、c1、a和a3)，cytb和cytc1、cytc在呼吸链中的中为电子传递体，a和a3以复合物物存在，称细胞色素氧化酶，其分子中除含Fe外还含有Cu，可将电子传递给氧，因此亦称其为末端氧化酶。第47页/共155页甲酰基多聚异戊二烯长链第48页/共155页它是电子传递链中一个独立的蛋白质电子载体，位于线粒体内膜外表，属于膜周蛋白，易溶于水。它与细胞色素c1含有相同的辅基，但是蛋白组成则有所不同。在电子传递过程中，cyt.c通过Fe3+

Fe2+

的互变起电子传递中间体作用。5.细胞色素c第49页/共155页复合物Ⅲ的电子传递比较复杂，和“Q循环”有关。辅酶Q能在膜中自由扩散，还原型辅酶Q（氢醌）将一个电子交给Fe-S→细胞色素c1→细胞色素c，被氧化为半醌，并将一个质子释放到膜间隙，半醌将电子交给细胞色素b566→b562，释放另外一个质子到膜间隙。一对电子由辅酶Q到复合物Ⅲ的电子传递过程中，共有四个质子被转移到膜间隙，其中两个质子是辅酶Q转移的。Q循环是指在线粒体内膜中电子传递链上QH2分别传递一个电子到细胞色素中，即共使2个细胞色素得到电子，从而被氧化。第50页/共155页第51页/共155页第52页/共155页ComplexIIIubiquinone-ubiquinoneox

whilecytCgetsreducedAlsocontainscytochromesbprotonpump4H+

Addstogradient8H+/NADH4H+/FADH2第53页/共155页简写为cyt.c氧化酶，即复合物IV，它的作用是将还原型细胞色素c的电子传递给分子O2，生成H2O。它是位于线粒体呼吸链末端的蛋白复合物，由12个多肽亚基组成。cyt.a和a3组成一个复合体，除了含有铁卟啉外，还含有铜原子。cyt.aa3可以直接以O2为电子受体。在电子传递过程中，分子中的铜离子可以发生

Cu+

Cu2+

的互变，将cyt.c所携带的电子传递给O2。6.细胞色素氧化酶第54页/共155页

复合物Ⅳ（细胞色素氧化酶）由6-13条多肽链组成，总的相对分子质量约60×103-170×103，以二聚体形式存在。每个单体包括细胞色素aa3和含铜蛋白。其作用是催化电子从还原型细胞色素c传递给氧分子，同时发生质子的跨膜移位。所以复合物Ⅳ既是电子传递体，又是质子移位体。

第55页/共155页ComplexIVreductionofoxygencytochromeoxidasecyta+a3red--->oxidizedstateoxygen--->water2H++2e-+½O2--2H2Otransferse-oneatatimetooxygenPumps2H+outTotalof10H+/NADHTotalof6H+/FADH2第56页/共155页ElectronTransportChainGroupsofredoxproteinsOninnermitochondrialmembraneBindingsitesforNADHandFADH2OnmatrixsideofmembraneElectronstransferredtoredoxproteinsNADHreoxidizedtoNAD+FADH2reoxidizedtoFAD第57页/共155页4ComplexesproteinsinspecificorderTransfers2electronsinspecificorderProteinslocalizedincomplexesEmbeddedinmembraneEaseofelectrontransferElectronsultimatelyreduceoxygentowater2H++2e-+½O2--H2O第58页/共155页第59页/共155页ComplexI:NADHentersatNADHdehydrogenase(alsoNADH:ubiquinoneoxidoreductaseorNADH-Qoxidoreductase).(complexII):succinateDehydrogenaseFADH2offlavoproteinsalsotransfertheirelectronstoubiquinone(Q),withnoH+pumped.第60页/共155页(ComplexIII)

Cytochromebc1complexpasses2e-from1QH2to2cytochromece-transferring&H+pumpinginComplexIIIviatheQcycle(foreach2e-transferred,4H+arereleasedatthePsideand2H+takenfromtheNside(matrix))ComplexIV:Cytochromecoxidase,theterminalenzymeoftherespiratorychain,contains3Cuand2hemeAgroupsaselectroncarriers第61页/共155页Thesequenceofelectroncarriersshouldbe

predictablebasedontheirredoxpotential第62页/共155页电子传递的抑制效应

凡是能够阻断电子传递链中某部位电子传递的物质称为电子传递抑制剂，由于阻断部位物质的氧化还原状态能被测定，所以利用电子传递抑制剂是研究电子传递顺序的重要方法，下面列举了若干种常见的重要的电子传递抑制剂。第63页/共155页

1、鱼藤酮等

阻断从NADH向CoQ的传递

鱼藤酮（rotenone）、安密妥（amytal）、杀粉蝶菌素（piericidine）等。它们的作用是抑制复合物I，阻断电子由NADH向CoQ的传递，但不影响FADH2到CoQ的氢传递。鱼藤酮是一种极毒的植物毒素，常用作杀虫剂。第64页/共155页

2、抗霉素A

阻断复合物Ⅲ的电子传递抗霉素A（antimycinA），它是从灰色链球菌分离出的一种抗生素，抑制复合物Ⅲ的电子传递，即阻断细胞色素还原酶中电子的传递，从而抑制了电子从还原型的CoQ（QH2）到细胞色素c1的传递。第65页/共155页

3、氰化物、叠氮化物、CO、H2S

阻断复合物IV向O2的传递

氰化物（cyanide,CN－）、叠氮化物（azide,N3－）、一氧化碳（carbonmonoxide,CO）和硫化氢(hydrogensulphide)，这些抑制剂均能阻断电子在细胞色素氧化酶的传递，即阻断细胞色素aa3至O2的电子传递，其中氰化物（CN－）和叠氮化物（N3－）能与血红素a3的高铁形式（ferricform）作用而形成复合物,而一氧化碳（CO）则抑制血红素a3的亚铁形式（ferrousform）。第66页/共155页电子传递链中的抑制剂

第67页/共155页

代谢物在生物氧化过程中释放出的自由能用于合成ATP（即ADP+Pi→ATP）,这种氧化放能和ATP生成（磷酸化）相偶联的过程称氧化磷酸化。类别：

底物水平磷酸化电子传递水平磷酸化ADP+PiATP+H2O生物氧化过程中释放出的自由能二.氧化磷酸化作用第68页/共155页

OxidativePhosphorylationConceptOxidativephosphorylationistheprocessinwhichATPisformedasaresultofthetransferofelectronsfromNADHorFADH2toO2byaseriesofelectroncarriers.第69页/共155页电子传递和氧化磷酸化

柠檬酸循环及其它降解代谢途径产生还原型辅酶，包括NADH和FADH2，将其携带的电子经过电子传递，最终交给分子O2，形成H2O。在电子传递过程中释放出大量的自由能，这些自由能被用来推动ATP的合成。在呼吸电子传递链中，总反应式为

NADH+H++1/2O2

→NAD++H2O

ΔG0’=－220.07kj/molFADH2+1/2O2→FAD+H2O

ΔG0’=－181.58kj/mol

第70页/共155页还原型辅酶中的能量

在糖酵解和柠檬酸循环中，1分子葡萄糖完全氧化可以生成10个NADH和2个FADH2，它们氧化后可以释放出的自由能为

10×220.07+2×181.58=2563.86

kj/mol

1分子葡萄糖完全氧化释放的自由能为2870.23kj/mol

还原型辅酶中贮存的能量比例为：

（2563.86/2870.23）×100%=89.3%第71页/共155页氧化磷酸化的P/O比

磷氧比（P／O）是指一对电子通过呼吸链传递到氧所产生ATP的分子数。近年来很多实验结果都证明，以NADH作为电子供体时，测得的P/O比值大于2,所以P/O比值不一定是整数。例如，-羟丁酸经过NADH途径的P/O比值为2.4－2.6，产生的ATP数目为2.5；而琥珀酸经过FADH2的P/O比值为1.7，产生的ATP数目为1.5。第72页/共155页

目前被广泛接受的观点是：ATP、ADP和无机磷酸通过线粒体内膜的转运是由ATP-ADP载体和磷酸转位酶催化的。每合成1个ATP需要3个质子通过ATP合酶。同时，把一个ATP分子从线粒体基质转运到胞液需要消耗1个质子，所以每形成1分子ATP就需要4个质子的流动。因此，如果一对电子通过NADH电子传递链可泵出10个质子，则可形成2.5个分子ATP；如果一对电子通过FADH2电子传递链有6个质子泵出，则可形成1.5个ATP分子。第73页/共155页底物水平磷酸化：代谢物通过氧化形成的高能磷酸化合物直接将磷酸基团转移给ADP，使之磷酸化生成ATP。

氧化磷酸化：NADH或FADH2将电子传递给O2的过程与ADP的磷酸化相偶联，使电子传递过程中释放出的能量用于ATP的生成。氧化磷酸化的过程需要氧气作为最终的电子受体，它是需氧生物合成ATP的主要途径。第74页/共155页

20世纪30年代包括德国生物化学家、诺贝尔奖获得者Meyerhof&Warburg在内的许多生化学家对代谢过程中能量的产生和利用作了深入研究，发现无论在糖酵解或三羧酸循环等代谢过程中，都有伴随着ATP磷酸根的放出或

ADP得到磷酸根的变化这类化学能量高效率的传递方式，指出腺苷三磷酸（ATP）是代谢中能量产生和利用的关键化合物。第75页/共155页

1941年FritzLipmann引入“高能磷酸键

(～P)”的概念。1949年美国生化学家EugeneKennedy和AlbertLehninger发现线粒体含有三羧酸循环和呼吸链所需要的全部酶系统，并且发现生物氧化与ADP磷酸化相偶联构成了氧化磷酸化。但是，NADH的氧化和电子传递过程是如何与ADP磷酸化生成ATP反应偶联起来一直不清楚。第76页/共155页氧化磷酸化的偶联机理

1、线粒体ATP合酶（mitochondrialATPase）2、能量偶联假说

1953年EdwardSlater

化学偶联假说

1964年PaulBoyer

构象偶联假说

1961年PeterMitchell

化学渗透假说3、质子梯度的形成4、ATP合成的机制1978年获诺贝尔化学奖第77页/共155页ATP的合成部位

线粒体内膜上有许多球形突起，称为内膜球体（innermembranesphere）。这些球体通过一个柄连接到内膜中的基座上，我们把球体和柄合称为F1，基座称为Fo，F1和Fo合称复合体Ⅴ。在离体条件下，这种复合体有水解ATP的活性，所以开始称它为ATP酶，后来发现在完整的线粒体中它的功能是合成ATP，现在称它为ATP合酶。第78页/共155页

ATP产生的部位都是有大的电位差变化的地方，例如，NADH呼吸链生成ATP的三个部位是：E0'值在此三个部位有大的“跳动”，都在0.2伏以上。ATP产生的部位第79页/共155页电子传递链标准氧还电势、自由能变化和ATP形成部位示意图第80页/共155页第81页/共155页线粒体ATP合酶第82页/共155页超声波胰蛋白酶或尿素第83页/共155页电子传递形成跨膜的质子梯度

在电子传递过程中，还伴随有H+从线粒体内膜的基质侧，向内膜的外侧运输，结果造成跨线粒体内膜的质子梯度，这样在膜内外既造成质子的浓度梯度，又造成电势梯度，这种电化学势梯度贮存有能量，当质子由膜的外侧向内侧运动时，推动ATP合成。

第84页/共155页GenerationofATPProtondependantATPsynthetaseUsesprotongradienttomakeATPProtonspumpedthroughchannelonenzymeFromintermembranespaceintomatrix~4H+/ATPCalledchemiosmotictheory第85页/共155页比较著名的假说有三个：

化学偶联假说构象偶联假说化学渗透学说目前得到公认的是“化学渗透学说”。氧化磷酸化-能量偶联的机理第86页/共155页

这个假说是1953年由EdwardSlater最先提出。假说认为在NADH氧化和电子传递过程中产生了一种活泼的高能共价中间物，通过此中间物进一步氧化产生的能量来驱动ATP的合成。这一假说完全是依据底物水平磷酸化机理提出的，例如在糖酵解中，由3-磷酸甘油醛脱氢酶催化的反应就产生了一种活泼且具有高能磷酸基转移势能的酰基磷酸化合物1，3-二磷酸甘油，随后其分子中的高能磷酸基团在磷酸甘油酸激酶的作用下被转移到ADP生成ATP。虽然在糖酵解过程中存在这种例证，但是人们至今未能在线粒体中分离到与之相类似的高能共价中间物。化学偶联假说Chemicalcouplinghypothesis第87页/共155页

这个假说是1964年由P.D.Boyer提出。该假说认为作为电子传递体的蛋白质有两种不同的构象：低能构象和高能构象。电子传递的结果使低能构象转变为高能构象，后者再将能量传递给F0-F1-ATP合成酶，使之也发生构象变化，从而推动ADP磷酸化形成ATP。这种假说有一定的实验根据，在电子沿呼吸链流动时，观察到线粒体内膜发生迅速的物理变化，但由于测定构象比较困难，支持这个假说的实验太少。构象偶联假说Conformationalcouplinghypothesis第88页/共155页

英国生物化学家PeterDMitchell在1961年提出化学渗透假说，他认为电子传递释放出的自由能及ATP合成是与一种跨线粒体内膜的质子梯度相偶联的。也就是说，电子传递释放的自由能驱动H+从线粒体基质跨过内膜进入到膜间隙，从而形成跨线粒体内膜的H+电化学梯度。这个梯度的电化学势驱动ATP合成。由于该假说提出后逐渐拥有越来越多的实验证据，因而成为目前解释氧化磷酸化偶联机理最为公认的一种假说，并且PeterMitchell因提出该假说而获得了1978年的诺贝尔化学奖。

化学渗透学说Chemiosmotichypothesis第89页/共155页TheNobelPrizeforChemistryin1978PeterMitchell(1920-1992)MechanismofcoupledoxidativephosphorylationChemiosmotichypothesisIn1961,PeterMitchellproposedanovelidea-aprotongradientacrosstheinnermembranecouldbeusedtodriveATPsynthesis.第90页/共155页第91页/共155页

由上述化学渗透假说可知，该模型必需具备两个条件：一是线粒体内膜必须是质子不能透过的封闭系统，否则质子梯度将不复存在；二是要求呼吸链和ATP合酶在线粒体内膜中定向地组织在一起，并定向地传递质子、电子和进行氧化磷酸化反应。

第92页/共155页化学渗透假说的实验证据①

氧化磷酸化作用需要封闭的线粒体内膜存在。②线粒体内膜对H+、OH－、K+、Cl－等离子都是不通透的。③破坏H+浓度梯度的形成都必将破坏氧化磷酸化作用的进行。④线粒体内膜上的电子传递能够将H+从基质运输到膜间隙。⑤人造的脂质小泡上重组细菌紫膜质和F1FoATP合酶后，在照光时有ATP的合成。第93页/共155页质子泵出是需能过程

一个质子逆电化学梯度跨过线粒体内膜的自由能变化可以用下式表示ΔG=2.3RT[pH(膜内)－pH(膜外)]＋ZFΔΨ

式中，ΔΨ是膜电势，即膜内外的电势差。

ΔΨ=Ψ(膜外)－Ψ(膜内)第94页/共155页质子转移的两种假设机制（1）氧化－还原回路机制

该机制由Mitchell提出。他认为电子传递链中有一些电子传递体既可以传递电子，也可以结合H+，当它们被还原时，在膜内侧结合H+，而被氧化时，在膜外侧释放H+，这样就把H+从膜内运到了膜外。

第95页/共155页（2）质子泵机制

这个机制的内容是，电子传递导致复合体构象的变化，氨基酸残基在膜内侧结合H+，构象变化后在膜外侧释放H+，从而把H+从膜内侧运到膜外。第96页/共155页合成ATP与跨膜质子的数量关系

在生理条件下合成1个ATP所需的自由能大约为40～50kj/mol。至少需要两个质子跨膜回流释放的能量才够合成1个ATP。因为转移出膜外的质子有一部分漏回膜内，测定的结果表明，每合成1个ATP需要泵出2～3个质子。

第97页/共155页ElectronTransportThusCapturesEnergyasProton-MotiveForceDy=0.15-0.2V0.75pHunitshigherthanP-side10protonsarepumpedout,whichconservesabout200kJ/mol(ofNADH)aselectrochemicalpotentialWhenprotonsareallowedtoflowbackin,workcanbeperformed:thesynthesisofATP第98页/共155页

ProtonPumpingComplexesI,III,andIV“pump”protonsfromthemitochondrialmatrixspacetotheintermembranespace.ComplexIpumps4,complexIIIpumps4,andcomplexIVpumps2protonsperpairofelectronstransported.ProtonMotiveForceAgradientofprotonsiscreatedacrosstheinnermitochondrialmembranebytheelectrontransportchain.ItistheenergystoredinthisgradientthatislinkedtothesynthesisofATPfromADPandPi.

第99页/共155页F1和Fo的亚基组成

F1由5种肽链组成，α3β3γδε。Fo由3种疏水亚基组成，a1b2c9-12。Fo形成跨膜的管道，质子通过此管道流回到膜内侧时驱动ATP合成。F1的α、β、γ、δ和ε亚基分别由510、482、272、146和50个氨基酸残基组成，F1的总分子量为371kD。α、β亚基是同源的，每一个亚基结合有1个ATP，催化位点在β亚基上，α亚基上ATP结合位点的功能还不清楚，因为缺失这个位点并不影响F1的活性。第100页/共155页F1/F0ATPSynthaseF1

catalyticsubunit,madeof5polypeptides

a3b3gde.Focomplexofintegralmembraneproteinsthatmediatesprotontransport,madeof

a1b2c9-12F0isoriginally"F-o"foritsinhibitionbyoligomycinProtondiffusionthroughtheproteindrivesATPsynthesis第101页/共155页ATPsynthasecomprisesaprotonchannel(Fo)andanATPase(F1)F1:a3b3gde.Fo:ab2c10-12第102页/共155页

该假说是1964年由美国生物化学家PaulBoyer最先提出，他认为电子传递过程中，线粒体内膜上的蛋白质组分发生了构象变化，转变成一种高能形态。这种高能形态通过将能量转移到ADP合成ATP后，又得以恢复其原来的构象。随着人们对ATP合酶结构的研究和认识不断深入，在构象偶联假说的基础上形成了ATP合酶结合变化和旋转催化假说。

ATP酶-构象偶联假说第103页/共155页Boyer和Walker的工作

英国科学家Walker通过x光衍射获得高分辩率的牛心线粒体ATP酶晶体的三维结构，证明在ATP酶合成ATP的催化循环中三个β亚基的确有不同构象，从而有力地支持了Boyer的假说。

Boyer和Walker共同获得1997年诺贝尔化学奖。

美国科学家Boyer为解释ATP酶作用机理,提出旋转催化假说，ATP合酶结合变化和旋转催化假说认为，ATP合酶与底物核苷酸的作用是按照结合变化机理进行的。构成ATP合酶头部的α3β3亚基构成3个催化部位，中部的γε亚基在质子推动力的驱动下相对于α3β3作旋转运动认为ATP合成酶β亚基有三种不同的构象，一种构象(L)有利于ADP和Pi结合，一种构象(T)可使结合的ADP和Pi合成ATP，第三种构象(O)使合成的ATP容易被释放出来。在ATP合成过程中，三个β亚基依次进行上述三种构象的交替变化，所需能量由跨膜H+提供。第104页/共155页

当质子推动力驱使H+经F0质子通道进入时，F0组分质子化而发生构象改变，积累足够的扭矩力，推动γε相对α3β3旋转120°，使处于T态的催化部位释放ATP变成O态，同时L态催化部位上生成ATP变为T态，O态结合ADP+Pi变为L态侧面观顶面观第105页/共155页ATP酶作用机理

ADP+PiProtenFluxH+ATP+H2O

ATPADP+PiProtenFlux有于ADP与Pi结合的构象有于ADP与Pi生成的构象有利于ATP释放的构象第106页/共155页第107页/共155页分子马达

Fo的c亚基排列成环，c亚基的构象是一对反平行的跨膜螺旋，在胞质溶胶侧由一个短的发卡环连接。c亚基环形成一个转子（rotor），相对于a亚基旋转，a亚基作为定子（stater），a亚基由5个跨膜的α螺旋组成，在膜的每一侧有质子流动的通道（protonaccesschannels）。γ亚基将F1和Fo连接起来，在ATP合成时γ亚基也相对于(αβ)3复合体旋转。如果γ亚基固着在c亚基转子上，它们就可以一起转动。b亚基有1个跨膜片段和1个长的亲水头部，完整的定子由b亚基固着在a亚基的一端，并通过δ亚基与(αβ)3结合在一起。

第108页/共155页第109页/共155页

解偶联剂（uncoupler）是指那些不阻断呼吸链的电子传递，但能抑制ADP通过磷酸化作用转化为ATP的化合物。它们也被称为氧化磷酸化解偶联剂。最早发现的一个解偶联剂是2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol,DNP），它是一种弱酸性亲脂化合物，在pH7条件下，DNP以解离形式存在，不能通过线粒体内膜。但是在酸性环境中，DNP转变为脂溶性的非解离形式，可携带质子透过线粒体内膜，这样就破坏了电子传递形成的跨膜质子电化学梯度。氧化磷酸化的解偶联和抑制第110页/共155页

在解偶联剂存在时，电子沿呼吸链的传递能正常进行，但不能偶联产生ATP，这样就使电子传递所产生的自由能以热能的形式被消耗。由于DNP解偶联剂只专一性地抑制与呼吸链相偶联的ATP的形成过程，因此，它不会影响底物水平的磷酸化。1．解偶联剂（uncouplers）

NO2NO2O-NO2NO2OHNO2NO2O-NO2NO2OHH+H+线粒体内膜内外第111页/共155页

这类化合物直接作用于ATP合酶复合体，从而抑制ATP的合成。

它们使膜外质子不能通过ATP合酶复合体返回膜内，使膜内质子继续泵出到膜外显然越来越困难，最后不得不停止，所以这类抑制剂间接抑制了电子传递和分子氧的消耗。

寡霉素属于此类抑制剂，它与F0的一个亚基结合而抑制F1。2．氧化磷酸化抑制剂（inhibitors）第112页/共155页F1FoATP合酶的抑制剂

在ATP合酶的柄部有一种寡霉素敏感性付于蛋白(oligomycin-sensitivity-conferringprotein，OSCP)，这种蛋白使复合体对寡霉素敏感，使得寡霉素抑制ATP的合成。Fo的名称即来自于此。

二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodi-imide，DCCD）能够修饰Fo蛋白中某亚基的Glu残基，导致抑制质子通过Fo，这种能被DCCD修饰的蛋白又称为DCCD－结合蛋白。第113页/共155页3.离子载体抑制剂

离子载体抑制剂（ionophore）是指那些能与某种离子结合，并作为这些离子的载体携带离子穿过线粒体内膜的脂双层进入线粒体的化合物。这类抑制剂均是脂溶性物质，它们与解偶联剂的区别在于它们能结合除H+以外的其它一价阳离子，例如缬氨霉素（Valinomycin）可结合K+，短杆菌肽可结合K+、Na+和其它一价阳离子穿过线粒体内膜。因此离子载体抑制剂增大了线粒体内膜对一价阳离子的通透性，从而破坏了膜两侧的电位梯度，最终导致氧化磷酸化过程被抑制。第114页/共155页第115页/共155页线粒体外NADH的氧化磷酸化作用

酵解（细胞质）氧化磷酸化

（线粒体）

线粒体外的NADH通过间接的途径——

穿梭机制进入线粒体。动物细胞内已知有两个穿梭系统：

磷酸甘油穿梭系统，主要存在于肌细胞；

苹果酸穿梭系统，主要存在于肝细胞。

第116页/共155页OxidationofNADHinCytosolGlycerophosphateshuttle(muscle)Malate-aspartateshuttle(liver)第117页/共155页磷酸甘油穿梭系统

通过3-磷酸甘油与DHAP之间的转换，胞液中的NADH间接地转变为内膜上的FADH2，经由内膜上的3-磷酸甘油脱氢酶(也是以FAD为辅基的黄素蛋白)进入FADH2呼吸链。这种方式不通过复合物Ⅰ,因此只生成1.5分子ATP。第118页/共155页-磷酸甘油穿梭（线粒体基质）磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油FADFADH2NADHFMNCoQbc1caa3O2NADHNAD+线粒体内膜（细胞液）第119页/共155页Points:

Differentco-enzymeofglycerol-3-phosphatedehydrogenaseCytosol-----NAD+Mitochondria---FADFADH2:succinaterespiratorychaintocreate1.5ATPLocation:skeletalmuscle、nervecellGlycerophosphateshuttle第120页/共155页苹果酸穿梭系统

谷草转氨酶，苹果酸脱氢酶，以及一系列的透性酶。通过苹果酸与草酰乙酸之间的转换，间接地将细胞质中的NADH转变为线粒体内的NADH，从而进入NADH呼吸链。这种方式要通过复合物Ⅰ。第121页/共155页苹果酸-草酰乙酸穿梭作用细胞液线粒体内膜体天冬氨酸-酮戊二酸苹果酸草酰乙酸谷氨酸-酮戊二酸天冬氨酸苹果酸谷氨酸NADH+H+NAD+草酰乙酸NAD+线粒体基质苹果酸脱氢酶NADH+H+ⅣⅠⅡⅢ苹果酸脱氢酶谷草转氨酶谷草转氨酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为膜上的转运载体）呼吸链第122页/共155页第123页/共155页PointsCo-enzymeofMalatedehydrogenase:NAD+OxaloacetateinmitochondriaformaspartatetoexitfrommitochondrialmembraneNADHrespiratorychain:2.5ATPLocation:liver,myocardium

Malate-aspartateshuttle第124页/共155页Factorsaffectingoxidation

phosphorylationInhibitorsRegulationbyADPThyroidhormoneMitchondrialDNAmutation第125页/共155页Inhibitors

Inhibitorsofrespiratorychaine.g.rotenone、piericidinAandamobarbital,antimycinA,dimercaptopropanol(BAL)Uncouplere.g.dinitrophenol，DNPInhibitorsofoxidativephosphorylationinhibitingbothelectrontransportandADPphosphorylation.e.g.oligomycin第126页/共155页

电子传递受可用底物量和ADP量的调控。既无可氧化的底物又无ADP时为状态Ⅰ，加入ADP后为状态Ⅱ（无可用的底物），加入底物后为状态Ⅲ，ADP用完后为状态Ⅳ，再加入ADP后为状态Ⅲ，氧耗尽后为状态Ⅴ。RegulationbyADP第127页/共155页ThyroidHormoneNa+-K+ATPenzyme

ATPdegradation

ADP/ATPOxidativephosphorylation第128页/共155页MitchondrialDNAMutationCausedbyrelativelynakedmitochondrialDNAAffectingoxidativephosphorylationleadtoATPdecreaseSymptomsaredependentonthedifferentorgansneedforATP,e.gDM、hypertension、

Highcholesterol、Mg++downregulationMaternallyinheriteddiseases，Age-related第129页/共155页第130页/共155页Bioenergyischemicalenergy,studiedintermsoffreeenergyandfreeenergychange(G).ATPactsasthefreeenergycarrierincells.Bioenergyismainlyproducedviastepwiseelectronflow(redoxreactions)throughaseriesofelectroncarriershavingincreasinglevelsofreductionpotential(E).Electronsreleasedfromtheoxidationofnutrientfuelsareinitiallychanneledtoafewuniversalelectroncarriers(includingNADHandFADH2).Summary第131页/共155页ElectronscollectedinNADHandFADH2arereleased(atdifferententeringpoints)andtransportedtoO2viatherespiratorychain,whichconsistsoffourmultiproteincomplexes(I,II,III,andIV)andtwomobileelectroncarriers(ubiquinoneandcytochromec).Theorderofthemanyelectroncarriersontherespiratorychainhavebeenelucidatedviavariousstudies,includingmeasurementsofthestandardreductionpotentialandeffectsofvariousrespiratorychaininhibitors.第132页/共155页ElectrontransfertoO2wasfoundtobecoupledtoATPsynthesisfromADP+Piinisolatedmitochondria.ThechemiosmotictheoryexplainsthecouplingofelectronflowandATPsynthesis.ATPsynthasecomprisesaprotoncha