生物工程工程技术

生物工程工程技术第1页/共61页细胞工程细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。“白菜—甘蓝”具有生长期短，耐热性强和易于贮存等优点第2页/共61页①1958年，美国Steward在用野生胡萝卜游离韧皮部细胞进行体外培养的标本中，观察到已经高度分化的细胞可以重新分裂，而回复至胚性细胞状态。细胞工程的举例第3页/共61页1997年克隆羊“多莉”诞生第4页/共61页第5页/共61页一、细胞的全能性概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。

原因是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。受精卵的全能性最高在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。生殖细胞（尤其是卵细胞）体细胞比生殖细胞低很多第6页/共61页细胞分化与细胞全能性之间的关系第7页/共61页①一个受精卵发育成一个新个体，细胞除了经过有丝分裂使细胞数目增多以外，还必须经过细胞分化，使细胞在形态、结构和生理功能上均发生稳定性的差异，形成不同的细胞和组织。细胞分化是一个渐变过程，在胚胎发育的早期，细胞外观上尚未出现明显变化前，细胞分化前途就已经决定，以后依次渐变，不能逆转，因此分化是一种持久的、稳定的变化。细胞分化与细胞全能性第8页/共61页②由于体细胞是通过有丝分裂繁殖的，一般已分化的细胞都有一套与受精卵相同的染色体，携带有本物种的全部遗传信息，因此分化的细胞有发育成完整新个体的潜能，这就是细胞的全能性，因此，在合适的条件下，有些分化的细胞具有恢复分裂、重新分化发育成完整新个体的能力。③细胞具有全能性和全能性表达是两个不同的概念。体内分化的植物细胞具有全能性，但在体内不能表达，需在一定条件下离体培养才能表达。

④体内所有细胞中受精卵全能性最高，卵细胞比体细胞潜在的全能性高，分化的植物细胞比分化的动物细胞全能性易表达，但需一定条件下离体培养。

第9页/共61页二、植物细胞工程植物细胞工程的理论基础是：

植物细胞的全能性植物组织培养

植物体细胞杂交第10页/共61页离体的植物器官、组织或细胞

脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化再分化

的呈无定形状态的薄壁细胞）根或芽等器官植物体1、植物组织培养关键步骤:进行灭菌处理；植物激素：细胞分裂素与生长素之间的浓度比可以调控植株组培过程中芽和根的形成。当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。愈伤组织再分化过程应先诱导生芽，再诱导生根条件：适宜的养料、激素、温度和无菌条件第11页/共61页过程名称过程形成体特征条件脱分化由外植体成为愈伤组织排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞、色浅1、离体2、提供营养物质3、提供激素4、无菌再分化由愈伤组织成为幼苗或胚状结构有根、芽或有生根发芽的能力营养生长生殖生长发育成完整的植物体由根、茎、叶、花、果、种子组成栽培植物组织培养比较表第12页/共61页1.快速繁殖2.培育无病毒植物3.生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等4.制作人工种子5.转基因植物的培育植物组织培养技术的应用人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。人工种子有许多优点:

首先，它解决了有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。

第二，人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。

第三，人工胚乳中除含有胚状体发育所需的营养物质外，还可以添加各种附加成分，如固氮细菌、防病虫农药、除草剂和植物激素类似物等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。

第四，用人工种子播种可以节约粮食。第13页/共61页概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）原理：植物细胞的全能性优点：繁殖率高，可大批量生产取材少培养周期短保持优良性状快速繁殖第14页/共61页作物脱毒病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，甚至没有采用茎尖进行组织培养第15页/共61页人工种子结构：人工薄膜+胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）优点：不受气候、季节、地域的限制保留优良性状时间短，占地少技术：组织培养原理：细胞全能性第16页/共61页2、植物体细胞杂交

植物体细胞杂交是用两个来自于不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。

因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的。第17页/共61页3、植物体细胞杂交如何去壁？酶解法去壁纤维素酶果胶酶人工诱导原生质体融合有物理法和化学法两大类：

物理法是利用离心、振动、电刺激促使原生质体的融合；

化学法是用聚乙二醇（PEG）等试剂作为诱导剂诱导融合。第18页/共61页植物细胞融合植物细胞培养植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合（诱导膜融合、核融合在杂种细胞第一次有丝分裂时进行）杂合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞细胞分裂分化发育愈伤组织杂种植株纤维素酶、果胶酶植物体细胞杂交第19页/共61页原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体融合（人工诱导）

杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤组织）杂种植株的再生与鉴定第20页/共61页(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图第21页/共61页白菜甘蓝白菜－甘蓝植物体细胞杂交案例植物体细胞杂交应用第22页/共61页常见的植物细胞培养有：

1、花粉培养花粉或花粉洗涤后在培养基上剪碎，培养形成愈伤组织，分化形成根茎，生长为单倍体花粉植株，经加倍成为普通植株

花粉培养是目前育种重要手段之一第23页/共61页2、原生质体培养去壁（纤维素酶、果胶酶）细胞——原生质体——愈伤组织——根、茎——植株。细胞融合，基因转移必须要在原生质体上进行。二、细胞融合：（cellfusion）创立于60年代，指在一定的条件下将两个或多个细胞融合为一个细胞的工程，细胞融合又称细胞杂交（cellhybridyixation）杂种细胞的形成范围较广，不仅动、植物种内或种间可杂交，而且动、植物之间也可杂交。第24页/共61页如：1970年蕃茄与马铃薯之间的原生质体融合成功及杂种植株（pomato)的育成。以色列抗寒番茄的育成第25页/共61页植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化根或芽等器官植物体植物组织培养的条件：适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件第26页/共61页第27页/共61页4、植物细胞培养的应用利用植物细胞培养进行药物生产太平洋紫杉细胞生产抗癌药物-紫杉醇、人参细胞培养人参皂苷和人参多糖、毛地黄细胞培养转化毛地黄毒苷典型案例：紫杉醇生产

C47H51NO14

分子量：853.92第28页/共61页案例1

紫杉醇(Paclitaxel)是继阿霉素和铂类抗癌药之后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药，是一新发现的有丝分裂抑制剂，其作用机理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。

1967年美国化学家Wall和Wani等首先从太平洋紫杉（短叶红豆杉，Taxus.brevifolia）树皮中提取出来。该药于1990年进入Ⅲ期临床试验，1992年底获美国FDA批准上市。第29页/共61页

紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中，其中树皮中的含量最高，大约从12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。紫杉醇的国际市场价格为450美元/g第30页/共61页

日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量达到了0.05％，比树皮中紫杉醇的含量高达10倍。

Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养下，细胞内的紫杉醇含量超过了20mg/L。清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g/L干物质，利用代谢调控技术在2~3天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。第31页/共61页案例2利用植物细胞培养生产天然色素—紫草宁紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物，同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素使用。紫草宁产生于亚洲的多年生植物紫草的根部。但紫草资源严重不足，在日本，紫草已濒临灭绝，在我国，紫草（Arnebiaeuchroma)列入了国际二级保护植物第32页/共61页第33页/共61页紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草宁的无法满足市场需求。化学合成紫草宁的工艺非常复杂，且最终产率只有0.7％，生产成本昂贵。紫草宁在国际市场上售价高达7000美元/kg第34页/共61页1974年Tabata等就研究了用于培养紫草细胞的培养基。1981年Tabata和Fujita等又用大的培养容器进行细胞悬浮培养并获得了紫草宁衍生物。日本在1983年进行紫草细胞大规模培养来生产紫草宁。我国南京大学等从1986年开始对该项目进行研究，在进行大量的研究之后得出，在适当的条件下，培养的紫草细胞悬浮物中紫草宁含量占干重的14%，比紫草根中的含量高10倍。第35页/共61页二、动物细胞工程

其中，动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。动物细胞工程

常用的技术手段动物细胞培养动物细胞核移植和胚胎移植动物细胞融合生产单克隆抗体第36页/共61页动物细胞培养动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。第37页/共61页动物细胞培养10代左右幼龄动物组织剪碎胰蛋白酶处理细胞培养（原代培养）传代培养细胞株细胞系50代后原代培养：单个细胞传至十代左右传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养。细胞株：10到40、50代的细胞，遗传物质没发生改变。细胞系：超过50代的细胞，遗传物质发生改变，可无限增殖。第38页/共61页动物细胞生长特性细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。

要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。第39页/共61页动物细胞培养条件1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等）3、温度和PH

温度36.5+0.5度，pH7.2～7.44、气体环境

O2和CO2（95%空气和5%CO2

）第40页/共61页动物细胞培养技术的应用生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等健康细胞培养：如获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。用于检测有毒物质用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据第41页/共61页动物细胞融合物理法化学法生物法方法丧失感染活性

（不感染细胞）保留融合活性

（诱导细胞融合）紫外线仙台病毒第42页/共61页融合过程示意图第43页/共61页2、动物细胞培养的应用

1、许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、克隆抗体等，都可以借助于动物细胞的大规模培养来生产。2、用取自烧伤病人皮肤的健康细胞进行培养，可以获得大量自身的皮肤细胞，为大面积烧伤的病人移植。

3、培养的动物细胞用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。

4、医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。第44页/共61页单克隆抗体的概念单:单个细胞克隆:无性繁殖抗体:化学性质单一、特异性强第45页/共61页单克隆抗体的制备及技术原理什么叫单克隆抗体（monoclonalantibody)？首先从生物体的免疫反应谈起，当外源性物质在人体或动物血液中出现时，机体中有一些淋巴细胞便会作出反应，产生一些特殊的免疫球蛋白，叫抗体，而那些外源性物质称抗原，抗体与抗原能发生特异结合，从而清除杂物—免疫反应，达到保护肌体的作用。第46页/共61页抗原不同，它所诱发的抗体也不一样，如细菌或病毒表面存在着几种抗原，因此它们就会对应诱发出几种不同的抗体。过去：人们为了得抗体，根据上述原理，反复注射某种抗原到动物（如：兔、羊、马），然后从其血清中分离所需的抗体，长期以来，用经典方法得到的抗体，存在两个严重的缺点：1、抗体不均质，是一种抗体的混合物，特异性差；因而称为多克隆抗体。2、产量有限，“克隆”Clone，意为“纯系、无性繁殖系”。

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单克隆抗体，是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的抗体，且单一，特异和纯化的特性，故有极重要的作用。这项课题由1975年被两名免疫专家GeorgesKoehler和CesarMilstein解决的。1984年获得诺贝尔医学奖。杂交的原理：能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，又称杂交瘤，由于这些杂交中细胞进行继续分泌继承了双亲的遗传物质，因而它们不仅能表现出淋巴瘤细胞分泌单一抗体的能力，而且还能表现出骨髓细胞在体外大量繁殖的本领，这样，杂交瘤变成了一座制造单克隆抗体的理想工厂。第48页/共61页制备单克瘤隆抗体的具体方法有三步（一）抗原注射到小鼠体内进行免疫，取出免疫细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合。（二）用选择培养基，选出杂交瘤细胞，逐一克隆或扩增，从中挑出能产生抗体的杂交瘤细胞。（三）将杂交瘤细胞放在培养瓶中扩大培养基注射到动物的体液中作为腹水癌生长，再分离纯单克隆抗体。第49页/共61页单克隆抗体的制备抗原注入小鼠体内骨髓瘤细胞分离B淋巴细胞细胞融合杂交瘤细胞细胞培养选择培养细胞注入小鼠体内培养培养基体外培养从腹水提取从培养液提取单克隆抗体能产生抗体能无限增殖既能产生抗体又能无限增殖第50页/共61页单克隆抗体的制备第51页/共61页第52页/共61页单克隆抗体的应用

单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性非常明显。人们正在研究用单克隆抗体治疗癌症，就是在单抗上连接抗癌药物，制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞，又不会伤害健康细胞。第53页/共61页3、动物细胞融合

与植物原生质体融合的基本原理相同，诱导融合的方法类似。常用的融合剂有：

聚乙二醇、

灭活的病毒等。应用：制备单克隆抗体。第54页/共61页4、单克隆抗体的制备注入小鼠细胞融合分离抗原注入小鼠体内B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养选择培养细胞培养基体内培养体外培养从腹水提取从培养液提取单克隆抗体能产生的特定抗体

能在体外培养条件下大量增殖在灭活的仙台病毒或

聚乙二醇的诱导下融合第55页/共61页单克隆抗体的应用

1、单