质粒提取、定量与酶切鉴定课件

质粒DNA的提取、定量

与酶切鉴定ExtractionandIdentificationofPlasmidDNA实验流程图一、碱裂解法提取质粒三、质粒酶切二、质粒定量四、酶切产物的琼脂糖电泳检测最后做

掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握紫外吸收测定DNA的方法了解质粒酶切鉴定原理掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验目的实验材料大肠杆菌DH5a菌株pMD18-T载体易瑞质粒小量提取试剂盒TakaraEcoRI

限制性内切酶TakaraHindIII限制性内切酶Takara10×M酶切缓冲液BioWest电泳琼脂糖干粉0.5×TBE核酸电泳缓冲液EB核酸荧光染料Takara6×电泳上样缓冲液实验仪器微量移液器离心机恒温水浴箱紫外检测仪电泳仪水平电泳槽独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子基因工程常采用的载体一、碱裂解法提取质粒DNA碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法；质粒DNA释放法；酸酚法等质粒提取方法：碱裂解法基本原理

基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。染色体DNA：氢键断裂，变性。质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。（不完全变性）质粒DNA：复性，溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成缠连的网状结构。pH=12.6（碱性）NaAc溶液（pH4.8）pH=中性染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来离心pMD18-T溶液S1（细菌悬浮液）裂解液S2中和液S3洗涤液W洗脱液RNaseA(100mg/ml)DNA吸附柱试剂盒的组成：溶液S1：

50mmol/L葡萄糖

10mmol/L

EDTA 25mmol/LTris-HCl(pH8.0) 2毫克/毫升溶菌酶裂解液S2：200mmol/LNaOH 1%SDS中和液S3：3mol/LNaAc(pH4.8)溶液1,取1.5ml培养物加入Eppendorf管中，室温离心12000rpm×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。2,加入250μl溶液S1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。3,加入250μl裂解液S2，颠倒4～6次混匀（不要剧烈振荡），室温静置3min（不超过5min）。4,加入350μl中和液S3，立即温和颠倒6~8次混匀，至出现白色絮状沉淀。5，室温12000rpm离心10min。6,分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次600μl，室温12000rpm离心30s，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。7,向吸附柱中加入600μl洗涤液W，12000rpm离心30s，弃滤液。8,重复步骤7一次。9,空柱10000rpm离心2min。10,取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl56℃预热的洗脱液，室温放置1min，12000rpm离心1min，收集洗脱液（即纯化的质粒DNA），-20℃保存备用。

实验流程1.5mL菌液12000rpm1min菌体沉淀溶液S1250μl剧烈震荡裂解液S2250μl颠倒混匀4-6次中和液S3350μl温和地颠倒混匀6-8次12，000rpm10min室温静置3~5min至出现白色絮状沉淀取600μl上清至吸附柱管12，000rpm30s12，000rpm30s洗涤液W600μl12，000rpm30s12，000rpm2min取吸附柱至另一新EP管洗脱液50μl12，000rpm1min室温静置1min弃滤液空柱收集洗脱液备用洗涤液W600μl弃滤液弃滤液2.悬浮细胞1.收集细胞3.裂解细胞4.中和6.洗柱7.洗脱5.过柱分离加入洗脱液加入洗涤液W二、质粒DNA定量测定利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性基本原理紫外分光光度计操作步骤取5l提取的质粒DNA，加入95l蒸馏水混合均匀3.用紫外分光光度计测定A260DNA或RNA的定量A260=1.0相当于

50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）

20μg/ml寡核苷酸紫外光吸收法：DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0DNA或RNA的纯度判定三、质粒DNA的酶切分析质粒DNA:～3kb

载体:pMD18-T2.7kb

基因:CHD51.4kb限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为4～6个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶GGATCCCCTAGGEcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTTpMD18-T反应物

体积（µl)10×M酶切缓冲液2质粒DNA10HindIII1EcoRI1H2O

6在一个洁净的1.5ml离心管中混匀下列反应物：

混合后37℃水浴1～2h质粒DNA的酶切分析操作1234影响酶切反应的因素底物DNA的纯度反应系统：(反应缓冲液)反应体积：甘油浓度<5%保温时间与温度四、琼脂糖凝胶电泳电泳：带电粒子在电场中泳动的现象影响迁移率的因素？电场样品：大小（分子量）形状（构型）电荷共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA质粒DNA三种构型：共价闭环超螺旋线性开环的双链环状琼脂糖凝胶

琼脂糖（Agarose）是一种多聚糖，由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。胶浓度（％）线性DNA分子大小（kb）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围琼脂糖凝胶的制备上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀电泳：电压100v；30min结果观察：凝胶成像仪

琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳1.凝胶准备①称1g琼脂糖置三角瓶中，加0.5×TBE100ml；②微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；2.胶床准备①将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；②将胶床放在调整好的水平台上；铺胶：将冷却至60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5mm；室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀；上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6µl

；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；电泳条件：电压80v；时间25～30分钟；电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带13.取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。琼脂糖凝胶电泳上样1：DNAMarker（5

l

）2：提取的质粒DNA（5

l

）3：质粒DNA酶切产物

（10

l

）+-1234每组上2个样品DNAMarker(ladder)

LoadingBuffer

上样缓冲液EDTA甘油……………增大溶液密度溴酚蓝…………指示剂二甲苯胺蓝……指示剂组成0.5TBE,0.5-1.4%浓度的胶中，迁移率溴酚蓝=300bp

二甲苯胺蓝=4kbp

染色溴化乙锭(EthidiumBromide，EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,优点：染色操作简便，快速；灵敏度