理学核酸代谢

理学核酸代谢第1页/共69页限制性内切酶：能够识别双链DNA上特定核苷酸序列并进行切割的核酸内切酶。P285第2页/共69页1.核苷酸的生物合成P289动植物、微生物可合成嘌呤或嘧啶的核苷酸，基本途径有：

①利用核糖、磷酸、Aa、CO2、NH3合成核苷酸，不经过碱基、核苷的中间阶段，称为“从头合成”途径或“从无到有”途径；②利用体内游离的碱基或核苷合成核苷酸，称为补救途径。二、DNA的生物合成第3页/共69页2.基本概念P300DNA复制(replication)：在亲代DNA双链的每一条链上，按照碱基配对准确地形成一条新的互补链，结果生成两个与亲代链相同的DNA分子的过程；转录(transcription)：以DNA链为模板，通过碱基配对的方式将其中所含的遗传信息传给RNA链，合成与DNA互补的mRNA链的过程；翻译(translation)：以mRNA链为模板，按照mRNA分子上三个核苷酸决定一种Aa的规则，合成具有特定Aa顺序的蛋白质的过程；第4页/共69页中心法则(TheCentralDogma)：由DNA决定RNA的碱基顺序，又由RNA决定蛋白质中的Aa顺序，这叫中心法则，也叫信息流。P301第5页/共69页(一)DNA的复制概念：复制时，DNA两条链解开，分别以每条链为模板合成互补链，形成的两个子代DNA中均有一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。1.DNA的半保留复制(SemiconservativeReplication

)P302第6页/共69页全保留复制半保留复制分散复制实验依据：1958年Meselson&StahlE.coli同位素标记（15N）结合密度梯度离心法第7页/共69页第8页/共69页2.DNA的半不连续复制P318

(Semidiscontinuousreplication)DNA的两条链方向是相反的(5’→3’，3’→5’)；DNA合成需要DNA聚合酶，它只能使DNA链从5’→3’合成，所以复制是半不连续的。5’3’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’第9页/共69页要点：①沿着复制叉(replicationfork)移动的方向，先合成前导链(leadingstrand)，前导链复制是连续的，其复制方向与复制叉移动方向一致；复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开的模板生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉P308。←复制方向复制叉第10页/共69页②另外一条链(随后链,laggingstrand)的合成是不连续的，复制叉打开后，也是按5’→3’方向即母链的3’→5’方向(与复制叉方向相反)合成若干个短片段，然后通过连接酶连接起来，所以整个过程是半不连续的。复制方向→冈崎片段(Okazakifragment)第11页/共69页冈崎片段P3081968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，因而将这些不连续的片段称为冈崎片段。第12页/共69页(2)条件P303-306底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合酶(polymerase)：依赖DNA的DNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，简写为DNA-pol；模板(template)：解开成单链的DNA母链；引物(primer)：提供3´-OH末端的寡核苷酸；其他的酶和蛋白质因子：DNA解链酶(helicase)

、DNA旋转酶(gyrase)、引物酶(primase)和引发体(primosome)、DNA连接酶(ligase)、单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)。第13页/共69页(1)引物酶已知的任何一种DNA聚合酶都不能从头合成一条新DNA链，DNA的合成需要一段引物。大多数细胞中引物为RNA，合成这些引物的酶称为引物酶。引物酶以单链DNA为模板，NTP为底物合成RNA。第14页/共69页(2)

DNA聚合酶以四种dNTP为底物，在DNA模板的指令下，按照碱基互补配对的原则，把dNTP逐个添加到引物或延伸链的3’－OH末端，形成3’,5’磷酸二酯键。新合成的链按5’→3’方向进行延伸。DNA聚合酶Ⅰ可以催化DNA链的延长（5’→3’聚合）由5’端水解DNA链（5’→3’核酸外切酶活性）由3’端水解DNA链（3’→5’核酸外切活性）校对第15页/共69页DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3’→5’外切酶活性。DNA聚合酶Ⅲ：真正起复制作用的酶由10种亚基组成的不对称二聚体α、ε和θ构成核心酶α亚基有聚合活性ε亚基有3’→5’外切酶活性第16页/共69页(3)连接酶催化双链DNA切口上5’-P与3’-OH的共价连接。连接反应需要能量。不催化两条游离DNA单链的结合。DNA连接酶在DNA复制、修复和重组过程均起重要作用。第17页/共69页(4)解螺旋酶（解链酶）利用水解ATP释放的能量，催化双链DNA解开形成单链。解链酶一般是多聚体的，最常见的是六聚体的形式。第18页/共69页(5)单链结合蛋白（SSB）稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。第19页/共69页(6)拓扑异构酶（旋转酶）兼有内切酶和连接酶的活力，既能水解，又能连接磷酸二酯键。Ⅰ型拓扑异构酶：使DNA一条链断裂和再连接Ⅱ型拓扑异构酶：使DNA两条链断裂和再连接第20页/共69页←旋转酶第21页/共69页(3)规律①DNA复制是半保留的；②DNA复制必须在特定的位点开始，这样的位点称为复制起始点(origin,ori)，原核生物只有一个复制起始点；真核生物染色体DNA有多个复制起始点，同时形成多个复制单位，两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)P317。第22页/共69页复制子第23页/共69页③DNA复制可以是单向的，也可以是双向的,后者更常见；原核生物的复制从一个起始点开始，同时向两个方向进行，称为双向复制，复制中的DNA成为状④两条DNA链的合成都是朝5’→3’方向进行；⑤DNA复制严格遵守碱基互补配对原则，准确复制；ori第24页/共69页⑥复制是半不连续的，前导链是连续合成的，随后链是不连续合成的，通过连接酶把若干片段连接起来；⑦各个短片段开始复制时，都需要RNA引物；⑧复制有多种机制，会因环境的不同(酶的丰度、温度、营养条件等)而有不同的起始机制及链的延长方式。第25页/共69页5.复制过程(大肠杆菌)P307分为三个阶段：(1)起始(initiation)

——RNA引物的合成(2)延长(elongation)

——向RNA引物3’端添加dNTP，合成DNA短的片段(3)终止(termination)——RNA引物脱落，代替相应的DNA序列，通过共价键连接短片段，形成DNA片段。第26页/共69页(1)起始DNA解成单链:由旋转酶松弛超螺旋，解链酶解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。解链酶第27页/共69页引物合成：引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物。（旋转酶）第28页/共69页(2)延长在DNApolⅢ催化下，以解开的单链为模板，以四种dNTP为原料，进行聚合作用,即新进入的dNTP与引物3´－OH形成磷酸二酯键，由5´3´方向延长子链。第29页/共69页

随后链的模板绕DNA聚合酶向后回折成环，复制叉上的DNA聚合酶III全酶同时合成前导链和随后链。第30页/共69页(3)终止不连续片段的连接DNA聚合酶IDNA聚合酶I第31页/共69页（4）真核生物的DNA复制P310基本过程类似于原核生物的DNA复制，但有不同：真核生物有多个复制起点；真核生物有五种DNA聚合酶(α、β、γ、δ、ε)；真核生物线性染色体末端的DNA叫端粒(telomere)，端粒的复制是由端粒酶(telomerase)催化的。第32页/共69页真核生物复制的终止:染色体DNA呈线性，复制在末端停止。第33页/共69页第34页/共69页(二)逆转录作用P312概念：以RNA为模板合成DNA，这个过程与转录相反，故叫逆转录，由逆转录酶催化。依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H依赖DNA的DNA聚合酶逆转录过程中cDNA的合成第35页/共69页前病毒学说（Temin）——逆转录过程生物学意义：扩充了中心法则；有助于致癌机制、艾滋病起因的研究；与真核细胞分裂和胚胎发育有关；逆转录酶是分子生物学重要工具酶。逆转录病毒的生活周期第36页/共69页依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNA的DNA聚合酶逆转录过程中cDNA的合成第37页/共69页7.DNA的损伤与修复P312紫外线、辐射可引起DNA损伤，使DNA链中相邻的嘧啶形成一个环形丁烷，主要是胸腺嘧啶二聚体；可通过两种修复系统除去：一种是光复活修复系统（光复活酶，蓝光），另一种是暗修复系统。第38页/共69页紫外光T-T二聚体可见光激活该酶只有高等哺乳动物该功能退化掉了。例对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境。光复活酶结合于损伤部位(1)光复活修复第39页/共69页（2）DNA的切除修复第40页/共69页（3）DNA的重组修复胸腺嘧啶二聚体复制核酸酶及重组蛋白修复复制DNA聚合酶ⅠDNA连接酶重组提问：原损伤部位没有修复，对后代影响大吗？第41页/共69页8.突变(Mutation)P315DNA上的碱基序列发生突然而稳定的变化叫突变；突变的形式有：插入——插入一个或几个碱基，置换(常见)——一个或几个碱基的置换，包括转换(嘌呤或嘧啶之间的置换)和颠换(嘌呤与嘧啶之间的置换)，缺失——一个或几个碱基的缺失(不可逆)；突变可以是自发的，也可以是诱发的(紫外线、γ－射线、叠氮物、亚硝酸等物化因素)。第42页/共69页二、RNA的生物合成在DNA指导的RNA聚合酶催化下，生物体以DNA的一条链为模板，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链，这个过程称为转录。1.概念(转录)第43页/共69页转录与复制的区别主要有：材料:4种NTP(复制为4种dNTP);mRNA中由U代替了T;复制是两条链同时进行，而转录只以其中的一条DNA链为模板进行转录(不对称转录)，这条链叫模板链(负链或无意义链),另一条链叫编码链(正链或有意义链)P316；DNA分子是整个被复制，而转录是局部的，有选择性的。第44页/共69页2.RNA聚合酶(转录酶)n1ATPDNA指导的RNA聚合酶n2GTPRNA前体+n3CTPDNA、Mg2+、Mn2+(n1+n2+n3+n4)PPin4UTP反应不需引物,直接在DNA模板上合成RNA合成方向5’→3’(RNA链的延长方向)

第45页/共69页大肠杆菌RNA聚合酶组成与功能P327

2个亚基：结合启动子核心酶亚基：催化RNA合成全酶亚基：结合DNA因子：负责识别启动子第46页/共69页3.RNA的转录过程(大肠杆菌)P317-319分为三个阶段：(1)起始阶段——转录因子识别起始位点，使RNA聚合酶结合到启动子(promoter)上，在起始区产生开放复合体。(2)延长阶段——RNA聚合酶沿着DNA模板链35方向滑动，催化RNA的合成(方向是53)。(3)终止阶段——当RNA聚合酶到达终止信号时,它和合成的RNA链一起从DNA上脱落下来。第47页/共69页启动子：指RNA聚合酶识别，结合和开始转录的一段DNA序列。P317转录因子：RNA聚合酶在进行转录时常需一些辅助因子(蛋白质)参与作用，称之为转录因子。终止子(terminator)：提供转录停止信号的DNA序列称终止子。终止因子：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子(蛋白质)。5’5’3’3’第48页/共69页(1)起始阶段转录酶全酶松弛地结合到DNA上;转录酶沿DNA滑行至启动子，由因子识别并紧密结合,形成闭合复合体;在–10区解链,形成开放复合体;催化ATP或GTP与另外一个核苷酸聚合，形成第一个3’,5’-磷酸二酯键，因子脱离。第49页/共69页(2)延长阶段转录酶沿模板链35方向移动，开放复合体(保持约17bp长)随之前移,RNA链沿53方向延伸，速度约为45核苷酸/秒。第50页/共69页(3)终止阶段当转录酶到达终止信号时，RNA-DNA杂交区被迫分离，酶和RNA均脱离DNA，转录结束。有两种转录终止方式：不依赖于因子的终止(自发终止)依赖于因子的终止(因子依赖型终止)第51页/共69页第52页/共69页依赖于因子的终止因子识别RNA上的rut位点，与之结合，然后向转录酶移动，当转录酶到达终止序列时，则停止合成RNA，于是因子赶上转录酶，使RNA-DNA杂交链解开，从而RNA和转录酶脱离，转录结束。第53页/共69页真核生物的RNA合成比原核生物复杂得多，RNA聚合酶有三种：

Ⅰ（A）核仁——rRNA前体

Ⅱ（B）核质——mRNA前体

Ⅲ（C）核质——tRNA和5sRNA前体第54页/共69页DNA模板功能抑制剂：放线菌素D、烷化剂、嵌入染料。P325RNA聚合酶的抑制剂：利福平——与原核生物RNA聚合酶的β亚基结合，阻止RNA合成；P325α-鹅膏覃碱——抑制真核生物RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ的活性，阻断mRNA的合成。P3214.转录过程的选择性抑制第55页/共69页5.转录后的加工原核：特定位点进行甲基化，产生甲基化修饰成分；核酸内切酶切除间隔区。P320(1)rRNA前体的加工30S第56页/共69页真核：100多个核苷酸残基被甲基化修饰，多数在核糖2’-OH上；RNaseⅢ及其它核酸内切酶裁切。第57页/共69页(2)

tRNA前体的加工P320核酸内切酶切断tRNA前体的两端；核酸外切酶从端部逐个切去附加的顺序，进行修剪；3’端加上-CCAOH(有一类tRNA本身就有，切去附加序列则露出)；核苷的修饰(甲基化、脱氨基和还原作用等)

。第58页/共69页(3)

mRNA前体的加工原核:mRNA大多不需加工，一经转录即可直接进行翻译,但也有少数多顺反子mRNA须通过核酸内切酶切成较小的单位，然后再进行翻译。真核：5’端形成特殊的帽子结构(m7G5’PPP5’NpNp-)；3’端切断并加上polyA尾巴；mRNA前体剪接除去内含子，连接外显子；有时链内部核苷被甲基化。P322第59页/共69页磷酸酶鸟苷酸转移酶甲基转移酶5’端加帽第60页/共69页第61页/共69页DNA

hnRNA第62页/共69页6.RNA指导下的RNA的合成(RNA复制)P324噬菌体Qβ的复制：以Qβ病毒的RNA(正链)为模板，在Qβ复制酶指导下合成互补链(负链)，再以负链为模板合成正链。病毒RNA复制的主要方式：以病毒的RNA为模板进行复制(Qβ病毒)；以病毒的RNA为模板，反向转录成DNA，再以DNA为模板，转录成病毒RNA(劳氏肉瘤病毒)。5RNA-533RNA+释放释放353355RNA+RNA+RNA-RNA-及RNA+的合成方向均为5‘3’第63页/共69页四、基因工程简介P3251.概念亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA(目的基因)和载体DNA重新组合连接(重组)，最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖(cloning，克隆)，或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。第64页/共69页2.基因工程的操作技术(1)体外基因重组