高效液相色谱

高效液相色谱

Highperformanceliquidchromatography,HPLC流动相固定相

基质、官能团基本内容

HPLC液相色谱流程图PUMPDetectorW泵分离柱检测器进样阀采用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入色谱柱进行分离测定的色谱方法。适用对象：高沸点、热不稳定有机及生化样品一、概述分析对象流动相差别GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%惰性气体HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，占有机物的80%液体，种类较多，选择余地广HPLC与GC区别一、概述HPLC&经典LC参数经典HPLC内径,cm1-5~0.4长度，cm50-10015-30填料粒度，um150-2003-7操作压力,atm1-1050-200分离时间0.5h-day~10

三高

一广

一快由于液体与气体性质的以下差异：液体中扩散系数比气体中小105倍左右液体粘度比气体约大102倍液体密度比气体约大103倍液体不可压缩二、影响分离的因素二、影响分离因素H=A+B/u+Cuλ↓球形固定相，高压、匀浆装柱法dp↓选粒径小的化学键合相C↓

选粘度小、低流速的流动相柱外效应又称柱外谱带扩展，是指色谱柱之外的造成色谱峰展宽的因素。是指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死空间。主要由进样装置、检测池及它们与柱之间的连接管路所产生,尽可能地减小柱外效应也是HPLC仪器制造技术革新的不断追求实验表明进样阀引起的柱效增加效果非常显著,柱外死体积减小后柱效增加134倍、分离度提高116倍2柱外＝2进样+2连接管+2接头+2检测池+2其它中心进样池体积匹配柱外效应标志？反相色谱正相色谱

亲水作用色谱离子色谱排阻色谱HPLC分类分离机制：分配机理固定相：非极性键合相

C18、C8流动相：极性流动相如:甲醇-水或乙腈-水或四氢呋喃－水样品极性与k的关系:极性↑、保留时间↓应用范围：非极性--中等极性组分(80%)反相色谱(RP-HPLC)反相色谱RPLC固定液极性<流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力固定相：极性固定相如氰基或氨基流动相：非极性溶剂（如正己烷）+极性调节剂（乙醇、四氢呋喃）流动相极性与k的关系：

流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓结构相近组分，极性大的组分后出柱应用范围：极性组分(20%)正相键合相色谱法(NP-HPLC)正相色谱NPLC固定液极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱HPLC流动相选择原则保持色谱柱的稳定性化学惰性适合所用的检测器对样品有一定的溶解能力清洗、更换方便、毒性小沸点、粘度等物理性质合适采用“HPLC”级溶剂细菌滋生水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率流动相的选择水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve鬼峰的出现流动相的选择溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2μm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱流动相的选择甲醇乙睛正己烷分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图流动相的选择滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和

有机溶剂溶剂的过滤流动相的脱气流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰柱中气泡使流动相绕流，峰变形基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡检测器气泡脱气的目的防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的检测信号不稳定

1）示差折射率检测器：*使折射率变化

2）UV检测器（200nm以下）：*溶解氧气有吸收

3）荧光检测器：*溶解氧气有消光作用流动相脱气方法真空超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度脱气机（氟树脂膜的减压脱气）可保持连续脱气，多用于低压梯度装置：

高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。梯度洗脱法优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度HPLC主要部件高压输液泵进样阀

色谱柱检测器HPLC主要部件(1)高压输液泵恒压恒流主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(2)梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。(2)进样阀

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：进样阀作用是将微量样品注入高压流动相中（3）分离系统——色谱柱

色谱柱是HPLC的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。色谱装填得好坏（填充密度）对柱效影响很大柱管材料主要是不锈钢。一般色谱柱长5～30cm，内径为4.6mm球型固定相筛板：能够使液体通过而阻止固定相移动氧化硅SiO2基质材料硅胶的特性：可耐高压、耐有机溶剂和水溶液易于引入多种官能团表面性质已被充分认识缺陷：可承受的pH范围有限（2-8）聚合物基质可承受的pH范围广（1-14）常用于离子交换模式的色谱系统分析小分子化合物柱效低（小的比表面）遇有机溶剂易溶胀固定相类型超高效液相色谱Ultra-performanceliquidchromatography,UPLC检测器－色谱系统的眼镜紫外检测器荧光检测器示差检测器蒸发光散射检测器灵敏度高重现性好响应快线性范围宽适用范围广对操作条件不敏感理想检测器的要求

常用的检测器类型

A紫外吸收检测器定量原理：朗伯比尔定律

特点：适用范围广、灵敏度较高、线形范围较宽、对操作条件不敏感（流速、温度变化）可用于梯度洗脱

类型单波长型可变波长型二极管阵列流通池A紫外吸收检测器类型单波长型

可变波长型

二极管阵列结构简单，灵敏度高、价格便宜无法自由选择波长A紫外吸收检测器类型

单波长型可变波长型

二极管阵列结构相对复杂灵敏度稍高价格较贵机械法选择波长A紫外吸收检测器类型

单波长型

可变波长型二极管阵列结构复杂灵敏度低价格贵光谱扫描快紫外检测器的重要进展：1024个二极管阵列各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。光电二极管阵列检测器A紫外吸收检测器流通池示差折光检测器

（refractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值与浓度呈正比特点：通用型灵敏度低对温度敏感、不能用于梯度洗脱R=z(n-n0)

溶剂折光指数（RI）温度水1.33320℃丙酮1.35820℃乙烷1.37520℃乙醇1.36218℃四氟呋喃1.40425℃乙二醇1.42720℃氯仿1.44618℃四氯化炭1.46315℃甲苯1.49620℃苯1.50120℃甲醇1.328620℃四氯化炭1.460320℃

荧光检测器

（fluorescencedetector）高灵敏度、高选择性对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应蒸发光散射检测器

(EvaportivelightScatteringDetector,ELSD)

在一定条件下，光散射强度正比于粒子大小和数量ELSD响应不依赖样品的光学特性，只要样品挥发性低于流动相均能被检测，不受其官能团的影响。ELS