系统生物学合成生物学与转录组学

系统生物学合成生物学与转录组学第1页，共69页，2023年，2月20日，星期二Genome

transplantation

in

bacteria:

changing

one

species

to

another天然完整基因组种间转移:

As

a

step

toward

propagation

of

synthetic

genomes,

we

completely

replaced

the

genome

of

a

bacterial

cell

with

one

from

another

species

by

transplanting

a

whole

genome

as

naked

DNA.

Intact

genomic

DNA

from

Mycoplasma

mycoides（蕈状支

原体）large

colony

(LC),

virtually

free

of

protein,

was

transplanted

into

Mycoplasma

capricolum（山羊支原体）

cells

by

polyethylene

glycol(PEG)-

mediated

transformation.

Cells

selected

for

tetracycline

resistance,

carried

by

the

M.

mycoides

LC

chromosome,

contain

the

complete

donor

genome

and

are

free

of

detectable

recipient

genomic

sequences.

These

cells

that

result

from

genome

transplantation

are

phenotypically

identical

to

the

M.

mycoides

LC

donor

strain

as

judged

by

several

criteria.---

Science.

2007

Aug

3;

317:632-8第2页，共69页，2023年，2月20日，星期二合成基因组---Science论文Science

2

July

2010:

Vol.

329.

no.

5987,

pp.

52

-

56Creation

of

a

Bacterial

Cell

Controlled

by

a

ChemicallySynthesized

GenomeDaniel

G.

Gibson,1

John

I.

GlassetalWereportthedesign,synthesis,andassemblyofthe1.08–mega–basepairMycoplasma

mycoidesJCVI-syn1.0genomestartingfromdigitizedgenomesequenceinformationanditstransplantationintoaM.capricolumrecipientcelltocreatenewM.

mycoidescellsthatarecontrolledonlybythesyntheticchromosome.TheonlyDNAinthecellsisthedesignedsyntheticDNAsequence,including"watermark"sequencesandotherdesignedgenedeletionsandpolymorphisms,andmutationsacquiredduringthebuildingprocess.Thenewcellshaveexpectedphenotypicpropertiesandarecapableofcontinuousself-replication.第3页，共69页，2023年，2月20日，星期二第4页，共69页，2023年，2月20日，星期二合成生命的关键步骤FirstSelf-ReplicatingSyntheticBacterialCell20-May-2010

1)合成供体的基因组DNA：首先，将蕈状支原体的全基因组测序，并按照该序列信息将其合成为1078条平均长度为1080bp的DNA片段。这些片段两两间具有80bp的部分重叠，所有片段拼接起来构成蕈状支原体的全长基因组。值得注意的是这些合成的片段较天然基因组略有一些改动，包括去除了14个不重要的基因、为阻断基因而设计的两个插入序列、27处单核苷酸多态性(其中19处在意料之中)以及4条用来区分于天然序列模本的“水印”标记(Watermark)，这些改动都不影响细胞正常的生命活动。该过程涉及到计算机对合成序列的精密计算。第5页，共69页，2023年，2月20日，星期二2)合成DNA片段的拼接：将以上合成的1078条DNA片段分别连接到载体，使其能在酵母细胞中通过同源重组拼接起来。于是，平均1080bp的DNA片段，10个一组拼接为大约10kb的片段(109个)，然后将这些连接有目的基因片段的载体从酵母中分离出来，转入大肠杆菌E.coli中进行扩增，以限制酶筛选出阳性克隆；之后再将阳性克隆质粒中的这109条10kb左右的片段按同样的方法每组10个拼接成100kb的片段(11个)；这11条片段最终拼接成完整的总共1077947bp的基因组(由于携带太大片段的载体在E.coli中不能稳定传代，因此后两步拼接中采用多重PCR来筛选阳性克隆)。此过程除了2个衔接反应是在体外用酶处理构建，其余所有的片段都是在酵母细胞内依靠同源重组拼接而成。第6页，共69页，2023年，2月20日，星期二3)人工基因组的甲基化修饰：由于供体细胞(蕈状支原体)和受体细胞(山羊支原体)共用同一套限制酶系统，而天然的供体基因组是经甲基化修饰的。因此，拼接完成的基因组DNA还需在体外用甲基化酶(从蕈状支原体或山羊支原体提取物中纯化)进行修饰，以避免受体细胞限制酶系统的阻碍。4)人工基因组移植入受体细胞：将构建好的人工合成基因组移植入山羊支原体内。细胞经过不断分裂传代，具有人造基因组的细胞在含抗生素的培养基中筛选出来，同时含有天然DNA的细胞逐渐消失殆尽。最终只剩下含有山羊支原体细胞质但由合成DNA控制的人工嵌合体细胞。虽然蕈状支原体和山羊支原体在基因组上75%是同源的，但该人造细胞明显表现出蕈状支原体的生长特性。第7页，共69页，2023年，2月20日，星期二合成生命操作图解

取名Synthia:人造儿创造这个可复制的试验性单细胞生物花费了4,000万美元第8页，共69页，2023年，2月20日，星期二人工合成基因组中的水印Thesecretaminoacidmessagescontainedin"watermarks"thatwereembeddedintheworld’sfirstmanmadebacterialgenome.NCBIcheckedintothegeneticsequencesubmittedbyVenter’sInstituteandfoundthewatermarkshiddeninplainsight.ThefivecodedmessagesthatwillgodowninhistoryasembeddedinthefirstsyntheticgenomeVENTERINSTITVTECRAIGVENTERHAMSMITHCINDIANDCLYDEGLASSANDCLYDE代表5个作者:CraigVenter,HamiltonSmith,JohnGlass,ClydeHutchison第9页，共69页，2023年，2月20日，星期二人工基因组组装与检测第10页，共69页，2023年，2月20日，星期二合成基因组结构图第11页，共69页，2023年，2月20日，星期二Transcriptomics转录组学第12页，共69页，2023年，2月20日，星期二Transcriptome:Anevolvingdefinition(Thepopulationof)mRNAsexpressedbyagenomeatanygiventime(Abbott,1999)转录组（Transcriptom）：细胞所包含mRNA的总和。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。转录组学（Transcriptomics）：研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数；比较不同功能状态下mRNA表达的变化，搜寻与功能状态变化紧密相关的重要基因群。

第13页，共69页，2023年，2月20日，星期二新定义Thecompletecollectionoftranscribedelementsofthegenome.(Affymetrix,2004)mRNArRNA,tRNAsnmRNAs(smallnon-messengerRNAs)microRNAsandsiRNAs(smallinterferringRNAs)snoRNAs(smallnucleolarRNAs)核仁小分子RNAsnRNAs(smallnuclearRNAs)Othernon-codingRNAsLongnon-codingRNA(lncRNA)第14页，共69页，2023年，2月20日，星期二转录本All

transcripts

All

mRNAs第15页，共69页，2023年，2月20日，星期二Transcriptomics

DefinitionThestudyofcharacteristicsandregulationofthefunctionalRNAtranscriptpopulationofacell/sororganismataspecifictime.ScopethepopulationoffunctionalRNA

transcripts.themechanismsthatregulatetheproductionofRNAtranscriptsdynamicsofthetrancriptome(time,celltype,genotype,externalstimuli)第16页，共69页，2023年，2月20日，星期二一、转录组学研究全部RNA的表达及功能转录组（transcriptome）指特定状态下一种细胞或组织所能转录出来的所有RNA的总和。——包括编码RNA，即mRNA和非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)转录组学（transcriptomics）：是在整体水平上研究细胞基因转录情况及转录调控规律的科学。RNA组学（RNomics）：是分析、鉴定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定状态下表达情况、功能及其与蛋白质的相互作用。第17页，共69页，2023年，2月20日，星期二转录组的特点：受到内外多种因素的调节，因而是动态可变的。能够揭示不同物种、不同个体、不同细胞、不同发育阶段及不同生理病理状态下的基因差异表达信息。第18页，共69页，2023年，2月20日，星期二基于测序：cDNA文库、illumina测序基于杂交：cDNA芯片（GeneChip，microarray）基因表达聚类转录组学的研究方法第19页，共69页，2023年，2月20日，星期二（一）微阵列是大规模基因组表达谱研究的早期主要技术大规模表达谱或全景式表达谱（globalexpressionprofile）：是生物体（组织、细胞）在某一状态下基因表达的整体状况。微阵列或基因芯片（DNAchip）:利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针，并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。第20页，共69页，2023年，2月20日，星期二SpottedMicroarrayscDNAArraysOligoArrays

InSituOligoSynthesisPhotosynthesisPlanersurfaceMicrofluidicschipE-fieldsynthesisIntegratedChips

IntegrateduF,microarrayanddetectionchipswithPCR,fluorescenceore-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramicsSiliconOthermaterials不同的生物芯片技术平台点样芯片原位合成芯片微流体芯片整合型芯片第21页，共69页，2023年，2月20日，星期二基因芯片的探针第22页，共69页，2023年，2月20日，星期二TaggedRNAfragmentsflushedoverarrayLaseractivationoffluorescenttagsOpticalscanningofhybridizationintensities基因芯片的杂交实验第23页，共69页，2023年，2月20日，星期二Experimentaloverview:HybridizationWashingScancy5channelScancy3channel“Overlayimages”Quantifypixelintensities.CellpopulationACellpopulationBRNAextractionAABBReversetranscriptionAABBKlenowlabelincorporationSampleBlabelledwithcy3dyeSampleAlabelledwithcy5dye第24页，共69页，2023年，2月20日，星期二Cy3和Cy5Cy3激发波长532nmCy5激发波长635nm第25页，共69页，2023年，2月20日，星期二图像扫描Cy5Cy3第26页，共69页，2023年，2月20日，星期二归一化第27页，共69页，2023年，2月20日，星期二LimitofDetection:1in30,000transcripts

~20transcripts/cellRed–increaseofCy5sampletranscriptsGreen–increaseofCy3sampletranscriptsYellow–equalabundance第28页，共69页，2023年，2月20日，星期二差异基因筛选原理：采用cy3/cy5的ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法对差异基因进行统计推断。方法：倍数法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5Z值法：Z=(X-μ)/σ

作用：发现两个样本间的差异表达基因，便于后续分析。第29页，共69页，2023年，2月20日，星期二MicroarrayandGeneChipApproachesAdvantages:RapidMethodanddataanalysiswelldescribedandsupportedRobustConvenientfordirectedandfocussedstudiesDisadvantages:ClosedsystemapproachDifficulttocorrelatewithabsolutetranscriptnumberSensitivetoalternativesplicingambiguities第30页，共69页，2023年，2月20日，星期二第31页，共69页，2023年，2月20日，星期二高通量测序高通量测序技术（High-throughputsequencing）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。第32页，共69页，2023年，2月20日，星期二第33页，共69页，2023年，2月20日，星期二高通量测序中重要名词解释1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深度为10×。2、覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中高GC含量，重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装的序列往往无法覆盖所有的区域，这些区域就叫做Gap。二者的关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证。第34页，共69页，2023年，2月20日，星期二3、RPKM（readsperkilobasepermillionreads）是每百万读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:

其中，totalexonreads指映射到某个基因上的reads数，mappedreads指map到所有基因的总的reads数。RPKM不仅对测序深度作了归一化，而且对基因长度也作了归一化，使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表达水平估计值具有了可比性，是目前最常用的基因表达估计方法。第35页，共69页，2023年，2月20日，星期二基于illumina测序的转录组分析：

RNA-seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第36页，共69页，2023年，2月20日，星期二TotalRNA样品检测

Agilent2100检测OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

第37页，共69页，2023年，2月20日，星期二第一天消化DNAmRNA的分离mRNA的打断cDNA的合成↓↓第二天末端修复↓↓加接头胶回收3’端加A第三天PCRPCR胶回收↓↓

文库制备↓↓第38页，共69页，2023年，2月20日，星期二cDNA:为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementaryDNA之缩写。以mRNA为模板，经反转录酶在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库第39页，共69页，2023年，2月20日，星期二真核mRNA的纯化mRNA的纯化主要通过磁珠吸附原理从而分离纯化Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3′的polyA与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。第40页，共69页，2023年，2月20日，星期二mRNA反转录纯化过的mRNA样品加入1µl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1µl的stopbuffer终止反应。加入沉淀剂（NaAc糖原无水乙醇）沉淀酶切产物。第41页，共69页，2023年，2月20日，星期二末端修复cDNA3′末端加AAdapter连接第42页，共69页，2023年，2月20日，星期二不同方法比较第43页，共69页，2023年，2月20日，星期二OHFlowCell接头diol

P7

P5

dioldiol模板杂交dioldiol

延长dioldiol

变性碱基片段杂交第44页，共69页，2023年，2月20日，星期二CTAGCTA5’-3’-…-5’GT

合成第一个碱基Cycle1:按顺序加入反应试剂

清除未反应的碱基和试剂

激发碱基荧光并收集荧光信号去除阻断基团和荧光基团Cycle2-n: 重复前面的步骤GTCTAGTCTGCTAGA基于SBS测序技术第45页，共69页，2023年，2月20日，星期二Clusterstation剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”(bridge)。形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应。反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“DNA簇群”。第46页，共69页，2023年，2月20日，星期二生物信息分析第47页，共69页，2023年，2月20日，星期二基因表达聚类分析转录组学方法的应用导致基因表达数据爆炸性增长。如何对这些数据进行分析，从中提取有意义的生物学信息，已成为转录组学的研究热点和技术瓶颈。聚类分析技术能将待处理的对象分配到相应的聚类中，使得同一聚类中的对象差别较小，不同聚类之间的对象差别较大。聚类分析技术在转录组学研究中，非常适合大批量分析基因群的功能。

第48页，共69页，2023年，2月20日，星期二基因表达聚类的数据表现Systematicvariationingeneexpressionpatternsinhumancancercelllines.

Nature,2000,Rossetal.第49页，共69页，2023年，2月20日，星期二第50页，共69页，2023年，2月20日，星期二第51页，共69页，2023年，2月20日，星期二有参考基因组序列信息分析流程第52页，共69页，2023年，2月20日，星期二Reads在基因组上的分布第53页，共69页，2023年，2月20日，星期二基因结构优化(Nagalakshmi,U.etal.,2008)

通过转录组测序鉴定出酵母3’和5’UTR区域第54页，共69页，2023年，2月20日，星期二

鉴定基因可变剪接exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA第55页，共69页，2023年，2月20日，星期二鉴定融合基因第56页，共69页，2023年，2月20日，星期二新转录本预测GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistributionPaired-End(PE)Reads第57页，共69页，2023年，2月20日，星期二NEngJMed2009SNP分析第58页，共69页，2023年，2月20日，星期二DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolution

revealshighcomplexityofthericetranscriptomeGenomeRes2010RiceTranscriptomeMaterial

callus

rootatseedlingstage（14d）

shootatseedlingstage（14d）

flagleaves（2stages）

panicle（3stages）Methods

RNASeq（paired-end&singleend）

DGE

smallRNA（18-30nt）基因功能注释基因结构分析鉴定出大量新转录本可变剪接鉴定基因融合鉴定第59页，共69页，2023年，2月20日，星期二无参考基因组生物信息分析Unigene功能注释Unigene的GO分类Unigene代谢通路分析预测编码蛋白框（CD