革兰氏染色法

翟乱孤I革兰氏染色法头验原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所应起的。①革兰氏阳性细菌的细胞壁G+细菌细胞壁具有较厚(20-80nm)而致密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁成分的60%〜90%，它同细胞膜的外层紧密相连(图2-9)。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸(teichoic-acid)，也称胞壁质(murein)，它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷，它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素(autolysins)酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G+细胞成为原生质体(protoplasts)，细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。②革兰氏阴性细菌的细胞壁G一细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄(15〜20nm)而结构较复杂，分外膜(outermembrane)和肽聚糖层(2〜3nm)(图2-10)。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙(periplasmicspace)。外膜G—细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同细胞质膜相同之处也是双层类脂，但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。。-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成，含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖)和二脱氧已糖。由于糖的种类不同，使各种G—细胞具有不同特性的LPS。核心多糖(corepolysaccharide)的主要组分是酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate,KDO)。外膜中还含有几种蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用(porin)，调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G一细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常称为内毒素(endotoxins)。肽聚糖层G一细菌细胞壁的肽聚糖层很薄，在大肠杆菌和其它细菌中仅有单层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。壁膜间隙G一细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙，一层薄的肽聚糖处于其间，肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽，肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12〜15nm，呈胶胨态。其间含有三类蛋白质：水解酶，催化食物的初步降解；结合蛋白，启动物质转运过程；化学受体(chemoreceptors)，在趋化性中起作用的蛋白。实验步骤：1、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/4处下面用记号笔分别标明S，分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内(注意涂片切不可过于浓厚)。2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次，不可过热，以载玻片不烫手为宜。4、染色：初染：加草酸铵结品紫一滴，约一分钟，水洗。媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。复染：用番红液染1—2分钟，水洗。镜检：干燥后，置油镜观察。记录：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。(以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。)(注意事项：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不