2013级动医预防兽医实习5-多聚酶链式反应(PCR)技术

2013级动医预防兽医实习5-多聚酶链式反应(PCR)技术第一页，共34页。1.学习掌握PCR反应原理;

2.掌握PCR技术的操作过程;

3.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。一、实验目的第二页，共34页。二、实验材料(一)试剂：

1、DNA模板

2、dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷）,包含dATP,dGTP,dTTP,dCTP。

3、10×PCR缓冲液(含Mg2＋)

4、rTaq酶5、上、下游引物

上游引物:5`-GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3`

下游引物:5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3`

6、琼脂糖

7、DNA相对分子质量标准物

8、吸头、PCR管和EP管等。

第三页，共34页。二、实验材料（二）器材

PCR仪,电泳仪,电泳槽,微量移液器，凝胶成像系统等第四页，共34页。三、PCR技术背景

1953年，DNA被发现是细胞里的携带遗传信息的分子。1971年，Khorana等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1973年，台湾女科学家钱嘉韵分离出耐热的Taq聚合酶。1985年,

美国KaryMullis发明了PCR技术,并在science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,KaryMullis荣获1993年诺贝尔化学奖。第五页，共34页。凯利·穆利斯(KaryBanksMullis)第六页，共34页。四、实验原理PCR技术是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝，PCR技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命.目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。第七页，共34页。PCR

基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。

四、实验原理第八页，共34页。PCR三个基本反应步骤：1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。2.退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。四、实验原理第九页，共34页。PCR技术的原理：1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。四、实验原理第十页，共34页。第十一页，共34页。第十二页，共34页。第十三页，共34页。第十四页，共34页。1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第十五页，共34页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃第十六页，共34页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55℃引物1引物2DNA引物第十七页，共34页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第十八页，共34页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始第十九页，共34页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55℃TaqTaqTaqTaq第二十页，共34页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第二十一页，共34页。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增第二十二页，共34页。25uL的PCR反应体系纯水16.0

uL10*Buffer

2.5uL4种dNTP混合物2.0uL引物（上、下）2.5uL模板DNA

2.3uLTaqDNA聚合酶0.3uL五、实验内容第二十三页，共34页。五、实验内容PCR反应程序：(1)95℃变性5min，(2)95℃变性1min，(3)57℃退火30sec，(4)72℃延伸1min。

重复(2)-(4)35次（5）72℃延伸10min。三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。第二十四页，共34页。五、实验内容PCR反应五要素：1.引物（primer）2.酶（TaqDNApolymerase）3.dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）4.模板（template）5.Mg2+（magnesium）第二十五页，共34页。五、实验内容第二十六页，共34页。五、实验内容第二十七页，共34页。五、实验内容第二十八页，共34页。五、实验内容第二十九页，共34页。六、实验结果M：对照；

1-6：PCR产物（5ul样品）第三十页，共34页。特异性强灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA七、PCR特点第三十一页，共34页。八、注意事项1、污染PCR能够从极少的样品中，分离出其中的DNA作为模板，对其特定的序列进行大量的扩增。如果样品污染了，特别是扩增系统化中混入了以前扩增的靶序列，将会与样品一样大量扩增，使实验结果难以区别。2、设对照实验。即除不加入模板DNA外，实验的全过程与本实验完全相同的条件同时进行，对照试验不出现扩增电泳带，说明PCR操作过程没有受到污染，反之，说明已污染。。第三十二页，共34页。八、注意事项3、隔离操作PCR扩增仪应与PCR操作场所分开。操作中应戴未污染薄胶手套，所用的试剂及操作仪器应尽可能放在专用柜中