第二章第五节

第二章第五节1第1页，共92页，2023年，2月20日，星期一烟草质体色素的分类、含量

植物色素按照其在细胞内的存在位置分为两类：

质体色素——存在于细胞内质体中，有叶绿素和类胡萝卜素；

细胞液色素——溶解在细胞液中，包括黄色素和花色素。

烟草质体色素主要包括叶绿素和类胡萝卜素（胡萝卜素和叶黄素等）。含量：

一般新鲜烟叶中叶绿素的含量范围为0.5～4%；

成熟烟叶中类胡萝卜素的总量约为叶绿素含量的1/5～1/3。第2页，共92页，2023年，2月20日，星期一一、烟草中的叶绿素（Chlorophyll,Chl）

高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b两种。在颜色上：叶绿素a(C55H72O5N4Mg)呈蓝绿色,

叶绿素b

呈黄绿色。第3页，共92页，2023年，2月20日，星期一1、叶绿素的结构

叶绿素是一个含氮杂环化合物。整个分子由一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴”组成：卟啉环——由四个吡咯环的α-碳原子通过甲烯基（=CH-）相连而成（卟吩环），呈平面型，中间的空隙里以共价键和配位键与镁结合（取代卟吩称为卟啉化合物）；叶绿醇（phytol

）：

第4页，共92页，2023年，2月20日，星期一叶绿素a的结构式当C3上的甲基（－CH3）被醛基（－CHO）取代时，为叶绿素b

C3叶绿醇

共价键配位键

头

尾第5页，共92页，2023年，2月20日，星期一2、叶绿素的含量新鲜烟草中叶绿素的含量（mg/g）烟草类型叶绿素a叶绿素b烤烟NC952.180.67烤烟SC581.310.37白肋烟212.210.58第6页，共92页，2023年，2月20日，星期一不同部位叶片叶绿素的含量（mg/g）部位含量下部叶1.258中部叶1.445上部叶2.154第7页，共92页，2023年，2月20日，星期一3、

叶绿素对烟质的影响

烟叶在调制过程中，绝大部分叶绿素降解消失。由于叶绿素是与蛋白质、脂类相结合以复合体的形式存在，那么当叶绿素降解的同时，蛋白质同时也降解。因为烟叶中与叶绿素结合的蛋白质约占蛋白质总量的50%左右，所以当叶绿素绝大部分被分解、烟叶显现黄色的时候，蛋白质也得到了充分的降解，淀粉的转化、分解也达到了充分的程度，烟叶内部可自行调节的生化过程即将结束（即调制变黄期结束）。第8页，共92页，2023年，2月20日，星期一二、类胡萝卜素类胡萝卜素是以异戊二烯残基为单元组成的一类物质，也称萜类化合物。烟草中的主要类胡萝卜素：叶黄素（lutein）、新黄质(neoxanthin)、紫黄质(violaxanthin)、玉米黄质(zeaxanthin)、隐黄质（cryptoxanthin）、六氢番茄红素(lycopene)、八氢番茄红素（phytoene）、β-胡萝卜素(β-carotene)及其上述物质的异构体等。

第9页，共92页，2023年，2月20日，星期一1、类胡萝卜素的结构按类胡萝卜素的化学结构可分为：

①双环化合物，如α-胡萝卜素和β-胡萝卜素；②单环化合物，如γ-胡萝卜素；③无环化合物，如番茄红素。已知三类胡萝卜素达300种以上。这些化合物的分子中都含有一个较长的共轭体系，是具有吸光特性而呈现颜色的结构基础。其颜色从黄色、橙色、红色以及紫色都有。大多数的天然胡萝卜素类都可以看作是番茄红素的衍生物。（番茄红素的结构）

第10页，共92页，2023年，2月20日，星期一番茄红素结构式为：

在分子结构上有11个共轭双键和2个非共轭双键（▲）组成的直链型碳氢化合物(为脂肪烃),分子式为C40H56。

▲▲第11页，共92页，2023年，2月20日，星期一主要类胡萝卜素：α-胡萝卜素（熔点187~188℃）β-胡萝卜素（熔点181~184℃）γ-胡萝卜素（熔点154℃）

八氢番茄红素双环化合物双环化合物单环化合物无环化合物双键位置第12页，共92页，2023年，2月20日，星期一2、叶黄素类的结构

叶黄素类是类胡萝卜素的含氧衍生物，多呈浅黄色、黄色、橙色等。烟叶中常见的叶黄素类有：叶黄素：化学名称为3，3’-二羟基-α-胡萝卜素；玉米黄素：化学名称为3，3’-二羟基-β-胡萝卜素；隐黄质：化学名称为3-羟基-β-胡萝卜素；紫黄素：化学名称为5，6-环氧-5，6’-环氧-玉米黄素。其化学结构如下：第13页，共92页，2023年，2月20日，星期一叶黄素玉米黄素

(-胡萝卜素)（α-胡萝卜素）第14页，共92页，2023年，2月20日，星期一隐黄质

新黄质

（具有环氧结构）(-胡萝卜素,单羟基)第15页，共92页，2023年，2月20日，星期一3、烟草中的类胡萝卜素HPLC分离新鲜烟叶中的类胡萝卜素

图中：1—顺式-新黄质；2−新黄质；3−紫黄质；4−黄体黄质；5−顺式-黄体黄质；6−顺式-紫黄质；7−叶黄素；8−玉米黄质；9−顺式-叶黄素a；10−顺式-叶黄素b；11−内标(β-阿朴-8'-胡萝卜醛)；12-β-胡萝卜素第16页，共92页，2023年，2月20日，星期一图中：1-顺式-新黄质；2−新黄质；3−紫黄质；4−黄体黄质；5−顺式-黄体黄质；6−顺式-紫黄质；7−叶黄素；8−玉米黄质；9−顺式-叶黄素a；10−顺式-叶黄素b；11−内标(β-阿朴-8'-胡萝卜醛)；12-β-胡萝卜素调制后烟草中的类胡萝卜素第17页，共92页，2023年，2月20日，星期一

从新鲜烟叶和调制后烟叶的色谱图上看：新鲜烟叶中分离出了11种类胡萝卜素及其异构体；

玉米黄质在新鲜烟叶中未检测出，而出现在烘烤后的烟叶中（这可能是由于在烘烤的热处理过程中，烟叶中紫黄质在脱环氧化酶的作用下转化成玉米黄质）。烘烤后的烟叶色谱图上，没有检测到紫黄质、黄体黄质以及它们的异构体（这可能是由于这些极性类胡萝卜素在热处理过程中不稳定，发生了降解）。

无论是新鲜烟叶还是烘烤后的烟叶都没有检测到α-胡萝卜素；黄体黄质及其异构体是第一次在新鲜烟叶中定性。第18页，共92页，2023年，2月20日，星期一

不同品种、不同部位新鲜烟叶中类胡萝卜素含量（µg/g）峰标号类胡萝卜素K326云烟85CB−1上部中部下部上部中部下部上部中部下部1顺式-新黄质9.647.954.0410.216.745.218.765.424.812新黄质70.2262.3340.8865.4750.1238.5759.2451.0936.463紫黄质68.1847.8337.6960.2744.6732.4652.3640.6629.534黄体黄质30.8921.0217.5326.8517.5914.2424.7316.7713.275顺式−黄体黄质2.553.163.774.693.622.964.023.953.066顺式−紫黄质11.4112.579.5812.9210.348.7511.8410.229.377叶黄素311.3259.4206.7326.2272.4198.6300.4245.5187.88玉米黄质−−−−−−−−−9顺式−叶黄素a60.8344.6941.7853.4347.4137.1249.8742.8334.7910顺式−叶黄素b21.7720.6518.6224.8120.1316.7420.6215.3312.5212β-胡萝卜素164.5154.8128.5160.2147.6119.3156.4134.7117.9总类胡萝卜素751.3634.4509.1746.1620.6473.9688.2566.5449.5第19页，共92页，2023年，2月20日，星期一相同品种、不同部位烟叶在烘烤前后类胡萝卜素含量（µg/g）峰标号类胡萝卜素新鲜红大烟叶烘烤红大烟叶上部中部下部上部中部下部1顺式-新黄质12.1111.465.95−−2新黄质79.4271.4356.8452.4346.2730.473紫黄质75.8266.7147.32−−−4黄体黄质34.8620.8618.94−−−5顺式−黄体黄质3.522.881.85−−−6顺式−紫黄质11.9610.238.08−−−7叶黄素372.5308.5274.7272.4258.1178.98玉米黄质−−−27.8122.0219.529顺式−叶黄素a6.855.194.567.186.486.0210顺式−叶黄素b33.6532.8425.3339.4534.67−11β-胡萝卜素189.4168.7136.5156.4144.8114.2总类胡萝卜素820.1698.8580.1555.7512.3349.1第20页，共92页，2023年，2月20日，星期一分析结果表明：

——相同品种，不同部位烟叶中，总类胡萝卜素含量从上部到下部依次降低（光照、温度和营养等不同的生长条件可能是类胡萝卜素含量差异的原因）。

——在不同品种以及不同部位烟叶中，各种类胡萝卜素含量大小依次为：叶黄素及其异构体>β-胡萝卜素>新黄质及其异构体>紫黄质及其异构体>黄体黄质及其异构体；

——不同部位烟叶在烘烤前后各种类胡萝卜素含量可以发现，烘烤过程中，各种类胡萝卜素均发生不同程度的降解。第21页，共92页，2023年，2月20日，星期一结论：

——叶黄素和β-胡萝卜素是烤烟烟叶中含量最高、最具代表性的两种类胡萝卜素；

——不同品种、不同部位烟叶中类胡萝卜素在组成分布上相似，含量上存在一定差异；

——烘烤前后烟叶中类胡萝卜素无论在组成上或是含量上均存在明显差异。第22页，共92页，2023年，2月20日，星期一三、调制(烘烤)过程中烟叶颜色的变化

烟叶烘烤——根据鲜烟叶素质以及在烘烤过程的变化，采用烧火供热和通风排湿等调控手段，提供相应的温度、湿度和持续时间等，促进烟叶发生充分和完善的生理生化变化，使烟叶变黄和失水干燥协调一致，最终实现烟叶烤黄、烤干、烤香的过程。烟叶的烘烤过程一般包括变黄阶段、定色阶段、干筋阶段等三个时期。第23页，共92页，2023年，2月20日，星期一变黄期：主要目标：使烟叶失水25～30%，叶片基本变黄。变黄前期：点火后以1℃/h将干球温度升至36～38℃至底台叶片发软、叶尖变黄10cm以上；二棚叶尖发软；三棚以上烟叶开始发汗，一般需12h左右，保持干湿差1～2℃。变黄中期：为主要变黄时期，以0.5℃/h将干球温度升至38~41℃

，稳温至二棚叶片基本全黄、完全塌架，顶棚叶片变黄七成以上，主脉逐渐变软，支脉遥渐变黄。变黄后期：以1℃/h将干球温度升至41～44℃，稳温至全炕叶片基本交黄、支脉全都褪去青色、主脉基本变软，此时是香气物质的原初物质形成的关键时期，在不过度变黄的情况下，适度延长时间对提高烟叶香气很有好处。第24页，共92页，2023年，2月20日，星期一

鲜烟叶第25页，共92页，2023年，2月20日，星期一变黄期第26页，共92页，2023年，2月20日，星期一定色期：主要目标：固定烟叶颜色、促使全炕叶片干燥。定色前期：将干球温度升至47～48℃稳温，湿球温度（标定空气相对湿度的一种手段

）稳定38℃，促使主脉变软、变黄，底棚烟叶大卷筒，二棚烟叶小卷筒。定色后期：以1℃/h将干球温度升至52~54℃稳温至全炕叶片干燥，湿球温度继续稳定在38~39℃；第27页，共92页，2023年，2月20日，星期一定色期第28页，共92页，2023年，2月20日，星期一干筋期：主要目标：主脉完全干燥；干筋前期：以1℃/h将干球温度升至58～60℃，二棚主脉全干；干筋后期：以1.5℃/h将干球温度升至68℃稳温至全炕叶脉干燥，要防止干球温度超过70℃，避免出现烤红现象。第29页，共92页，2023年，2月20日，星期一干筋期第30页，共92页，2023年，2月20日，星期一烟叶烘烤曲线第31页，共92页，2023年，2月20日，星期一1、烟叶在烘烤过程中色素的降解规律1）烟叶在烘烤过程中叶绿素的降解规律新鲜烟叶中既存在着叶绿素合成酶，也存在着叶绿素分解酶。因此，烟叶中的叶绿素在代谢过程中一方面合成，一方面分解，不断地更新，在烘烤过程中主要发生降解。

第32页，共92页，2023年，2月20日，星期一烟叶在烘烤过程中叶绿素的降解

随着烘烤的进行，烟叶中叶绿素的含量逐步减少，说明叶绿素随着烘烤的进行而逐渐降解，尤其是在变黄期降解量最大。第33页，共92页，2023年，2月20日，星期一烘烤时间/hNC89云烟85商丘信阳南阳三门峡商丘信阳南阳三门峡0--------122.011.741.251.281.431.211.281.28242.502.080.430.661.811.951.881.72360.170.051.882.180.950.690.710.60480.410.190.830.940.020.080.340.55600.080.110.110.410.020.080.020.12720.020.180.180.190.050.040.040.1684--0.050.10--0.070.2296--0.110.08--0.200.13

烘烤过程中叶绿素的降解速度

（mg·100g-1·h-1）第34页，共92页，2023年，2月20日，星期一

从叶绿素的降解速度看，不同生态区、不同品种烟叶表现了较大差异(上表)。降解速度——云烟85都是在24h降解速度最快；NC89中商丘和信阳烟叶是在24h最快，南阳、三门峡烟叶则是在36h最快。24～36h以后降解速度明显减慢。降解量——变黄期结束时，NC89中的平均降解量占鲜叶含量的74%；云烟85的平均降解量占鲜叶含量的75.5%。

烟叶完成变黄期以后，叶绿素仍然缓慢降解，直至干筋期时趋于稳定。不同品种表现出相似的规律性。

第35页，共92页，2023年，2月20日，星期一不同部位烟叶中叶绿素在烘烤过程中的降解

第36页，共92页，2023年，2月20日，星期一

烟叶部位叶绿素a叶绿素b叶绿素总量上部烘烤前（mg/g）1.0770.4621.539变黄后(mg/g)0.1980.0790.277降解量（%）81.682.982.0降解速度（%/h）1.701.731.71不同部位烟叶在变黄期叶绿素的降解量和降解速度

第37页，共92页，2023年，2月20日，星期一中部烘烤前（mg/g）0.9490.5111.460变黄后(mg/g)0.1530.0660.219降解量（%）83.887.185.0降解速度（%/h）1.741.811.77下部烘烤前（mg/g）0.8130.5431.356变黄后(mg/g)0.1220.0540.176降解量（%）84.990.087.0降解速度（%/h）1.771.881.81续表

第38页，共92页，2023年，2月20日，星期一

实验表明：

——烘烤前，上部叶中叶绿素a和叶绿素b的总量最高，其次为中部叶和下部叶。

——烘烤过程的变黄期是两种叶绿素降解量最大的时期。

——定色期，各部位烟叶中两种叶绿素的含量都有所回升，而且叶绿素a回升的量要高于叶绿素b。——干筋期，两种色素的含量基本保持稳定。第39页，共92页，2023年，2月20日，星期一

烘烤后，不同部位烟叶中总叶绿素损失量在83～86%范围内变化，降解量最大的是下部叶，其次是上部和中部叶。这与Pack报道的在烘烤45小时后叶绿素含量是烤前的15~20%基本一致。

第40页，共92页，2023年，2月20日，星期一

不同部位烟叶烘烤的难易程度：

如果使用相同的烘烤方法，一般情况下，下部烟叶比较易于烘烤，其次是中部烟叶，最后是上部烟叶。下部烟叶叶片较薄，结构较松，干物质较少，含水量较高，这些叶片在烘烤过程中变黄较快，脱水也较快，因而色素的降解也比较快；中部叶片厚度适中，含水适宜，干物质积累充足，叶片结构较为疏松，烘烤时变黄速度和失水速度易于协调，色素变化适中。

上部叶由于通风透光条件较好，叶片厚实，含水量少，变黄较慢，同时定色期的脱水相对也比较快，定色难，不易烘烤。第41页，共92页，2023年，2月20日，星期一2）烟叶烘烤过程中类胡萝卜素的降解规律

在烘烤过程中，类胡萝卜素的含量总体趋势是随着烘烤的进行逐渐下降。其中以变黄期降解速度较快。

第42页，共92页，2023年，2月20日，星期一不同部位烟叶在烘烤过程中类胡萝卜素含量的变化第43页，共92页，2023年，2月20日，星期一烟叶部位紫黄质叶黄素β

-胡萝卜素类胡萝卜素总量上部烘烤前（mg/g）0.0880.1870.1300.405变黄后(mg/g)0.0220.0560.0440.122降解量（%）75.070.066.269.8降解速度（%/h）1.561.461.381.45不同部位烟叶在变黄期类胡萝卜素的降解量和降解速度

第44页，共92页，2023年，2月20日，星期一烟叶部位紫黄质叶黄素β

-胡萝卜素类胡萝卜素总量中部烘烤前（mg/g）0.0750.1750.1140.365变黄后(mg/g)0.0180.0490.0340.101降解量（%）76.172.270.172.3降解速度（%/h）1.581.501.441.51下部烘烤前（mg/g）0.0620.1680.1090.339变黄后(mg/g)0.0140.0420.0280.084降解量（%）77.475.074.375.2降解速度（%/h）1.611.561.541.57续表

第45页，共92页，2023年，2月20日，星期一

——发现烘烤过程中易氧化的紫黄质降解最多；

——烘烤过程中，不同部位烟叶中总类胡萝卜素的损失最大的是下部叶，其次是上部叶和中部叶；

——总类胡萝卜素的降解速度要比总叶绿素小，所以在变黄后，表现出的一个最明显也是最重要的烟叶外观变化就是烟叶由绿变黄。两类色素的不同降解机理可能是导致其降解速度不同的主要原因。

第46页，共92页，2023年，2月20日，星期一2、色素的降解实质：烟叶变黄的本质是叶绿素、类胡萝卜素等色素的降解以及黄色色素比例的增加。降解过程如下：类胡萝卜素降解香气成分第47页，共92页，2023年，2月20日，星期一叶绿体蛋白调制分解游离叶绿素叶绿素酶叶绿醇（无色）+甲醇叶绿醇（又叫植醇）可以脱水形成新植二烯（一种重要的烟草增香剂，属于二萜类化合物），主要在调制和陈化过程中产生。第48页，共92页，2023年，2月20日，星期一降解速度：叶绿素>叶黄素>胡萝卜素变黄后：叶绿素——仅为原含量的10～20%；类胡萝卜素——占烘烤后色素总量的80%～90％。调制过程中颜色变化：色素均分解，但分解速度不同，使

各种色素含量比例发生改变，叶绿素大大减少，类胡萝卜素的黄色显现出来。第49页，共92页，2023年，2月20日，星期一3、烟叶调制过程中的酶促棕色化反应及其调控途径酶促棕色化反应——指调制变黄后期和定色期，在酶的催化下烟叶由黄逐渐变棕、变褐的过程。实质：酚类物质的快速氧化及产物的聚合（严重的褐变可致多酚降低85%左右）。

第50页，共92页，2023年，2月20日，星期一酶促褐变发生的条件：酚类底物酶氧三者缺一不可a、酶外渗：变黄后期和定色期，细胞破裂、死亡，使原本在细胞内的酶外渗；b、氧气大量进入；c、酶活性提高（温度升高使酶活性增大，45～50℃活性最高，大于55℃抑制活性）。

第51页，共92页，2023年，2月20日，星期一

酶促棕色化反应是一系列复杂的生物化学过程，它的剧烈发生会导致烟叶烤后色泽和香吃味的大幅度降低，造成烟叶使用价值的下降甚至丧失。研究调制过程中酶促棕色化反应的实质及其影响因素，探索有效防止烟叶棕色化变褐的途径，对于提高烟叶烘烤质量具有十分重要的意义。第52页，共92页，2023年，2月20日，星期一1）多酚氧化酶的酶学特性

多酚氧化酶是烟叶在烘烤过程中导致变成深色的主要原因之一，这是由于多酚氧化酶催化各种酚类物质（儿茶酚、单宁酸、酪氨酸等）氧化成醌，再经聚合形成黑色素所致。因此，研究多酚氧化酶在烟叶中的酶学特性，以及如何使用抑制剂抑制多酚氧化酶的活性，对于提高烟叶烤后质量具有重要意义。第53页，共92页，2023年，2月20日，星期一（1）热稳定性

按照酶活性测定系统，分别在35℃、45℃、55℃、65℃下进行酶活性测定，经计算测得不同温度、不同时间下烟草多酚氧化酶的活性结果如下图所示。不同温度条件下酶的活性差异很大。第54页，共92页，2023年，2月20日，星期一

温度越高，酶活性持续的时间越短，温度越低，酶活性持续的时间越长。即在35℃，烟草多酚氧化酶的活性在40min时仍然很高，而在65℃时，烟草多酚氧化酶在2min时几乎没有活性了。上述分析表明，烟草多酚氧化酶在35～45℃以下时是相当稳定的，最终表现出高活性；但当温度在55℃以上时，易迅速钝化失去活性。第55页，共92页，2023年，2月20日，星期一（2）耐酸碱性

分别在pH值为4、5、6、7、8六个条件下测定烟叶中多酚氧化酶的活性,当pH值达到6时，多酚氧化酶活性达到高峰,然后随着pH的继续增加（见下图）。

第56页，共92页，2023年，2月20日，星期一

烟草多酚氧化酶在不同pH下的活性第57页，共92页，2023年，2月20日，星期一

从图中可以看出,随着pH值的逐渐增加，烟草多酚氧化酶的活性先增加，达到最大值后又逐渐减弱，呈抛物线型。此外，从图中还可看出，该酶对碱性条件敏感，在偏碱情况下酶活性下降得快。第58页，共92页，2023年，2月20日，星期一（3）底物的专一性

将配制的不同浓度的焦儿茶酚、焦性没食子酸、苯酚与烟草多酚氧化酶作用，测定酶活性,求解烟草多酚氧化酶对焦儿茶酚（二元酚）、焦性没食子酸（三元酚）、苯酚（一元酚）三种底物的米氏常数（Km）值，结果如下表和图。第59页，共92页，2023年，2月20日，星期一烟草多酚氧化酶对三种底物的Km值底物名称底物浓度S（M）反应速度（V）S/VKm值（米氏常数）焦儿茶酚（二元酚）0.0020.722.77×10－31.52×10－30.0040.864.65×10－30.0050.955.84×10－30.0101.109.05×10－3焦性没食子酸（三元酚）0.0020.464.31×10－23.31×10－20.0040.685.68×10－20.0060.777.32×10－20.0080.888.04×10－2苯酚（一元酚）0.0020.01831.100－0.0040.0550.7270.0060.1300.4620.0080.4770.168第60页，共92页，2023年，2月20日，星期一

米氏常数Km是表示酶与底物亲合力大小的一个特征常数。Km值大时，说明酶和底物的亲合力小；Km值小时，则说明酶和底物的亲合力大。从上述结果可以看出，焦儿茶酚和烟草多酚氧化酶作用时，其Km值最小，为1.52×10-3，说明焦儿茶酚和多酚氧化酶的亲合力最强，故常用焦儿茶酚作底物，加速酶促反应的进行。焦性没食子酸和烟草多酚氧化酶作用的亲合力次之（Km值为3．3×10-2），而烟草多酚氧化酶不催化氧化苯酚，二者不表现出亲合力。

实验表明，烟草多酚氧化酶只作用于多元酚化合物，不催化氧化一元酚化合物。第61页，共92页，2023年，2月20日，星期一（4）抑制剂效应

在EDTA、亚硫酸氢钠、硼酸、柠檬酸四种抑制剂的抑制效果中，以硼酸和亚硫酸氢钠对酶活性的抑制效应最为明显，EDTA和柠檬酸次之。亚硫酸氢钠能抑制烟草多酚氧化酶的活性,是由于亚硫酸氢钠是还原剂，它使多酚氧化酶的二价铜还原为一价酮，使酶失活；硼酸、柠檬酸也能抑制烟草多酚氧化酶的活性,其原因可能是硼酸、柠檬酸改变了其酸碱性，降低了pH值，使多酚氧化酶和底物的结合力减小,进而降低了酶活性。硼酸降低百分数高于柠檬酸，说明硼酸的酸性比柠檬酸的酸性强。

EDTA对烟草多酚氧化酶的抑制作用，可能是由于EDTA能和一些金属离子（如Cu2+）结合形成螯合物沉淀，从而降低了酶活性。第62页，共92页，2023年，2月20日，星期一（5）激活剂激活效应

将用不同浓度的激活剂硫酸铜溶液处理的酶液在分光光度计上400nm处测其吸光度。实验表明，随着硫酸铜溶液浓度的增加，烟叶中酚类物质转化为醌类物质增多,吸光度增大。这说明，多酚氧化酶活性是增大的。

多酚氧化酶是一种含铜的蛋白质，铜离子有增强酶活性的功能，是烟草多酚氧化酶的良好激活剂。第63页，共92页，2023年，2月20日，星期一2）酶促棕色化反应（1）酶促棕色化反应的实质烘烤过程中烟叶酶促棕色化反应的发生其实质在于烟叶中的多酚类物质，如咖啡酸、绿原酸、芸香苷等，在过多氧化酶和多酚氧化酶的作用下，经氧化产生淡红色至黑褐色的醌类物质。烟叶中醌类物质积累和缩聚的结果导致了烟叶颜色由黄色转变为不同程度的褐色。多酚类物质中的绿原酸和芸香苷酶促氧化是褐色素形成和积累的先决条件。第64页，共92页，2023年，2月20日，星期一儿茶酚酶促棕色化反应的过程：

第一步：儿茶酚在多酚氧化酶作用下氧化成邻醌；第二步：邻醌或没有氧化的儿茶酚在酚羟化酶的作用下，发生羟基化反应，生成三羟基化合物；

第三步：邻醌和三羟基化合物在无酶参加下能自动发生氧化还原反应，三羟基化合物被邻醌氧化生成邻羟基对醌，而邻醌被还原为原来的酚类物质；

第四步：邻羟基对醌和对羟基邻醌易发生聚合，生成分子量较大的褐色色素。

第65页，共92页，2023年，2月20日，星期一1.2.3.4.黑色素黑色素儿茶酚在多酚氧化酶作用下氧化成邻醌邻醌或没有氧化的儿茶酚在酚羟化酶的作用下，发生羟基化反应，生成三羟基化合物邻醌和三羟基化合物在无酶参加下能自动发生氧化还原反应，三羟基化合物被邻醌氧化生成邻羟基对醌，而邻醌被还原为原来的酚类物质酚羟化酶邻羟基对醌和对羟基邻醌易发生聚合第66页，共92页，2023年，2月20日，星期一绿原酸酶促棕色化反应的过程：

绿原酸的酶促棕色化反应过程与儿茶碱的酶促棕色化反应的过程完全相同，只是酶促棕色化反应的速度慢。

第67页，共92页，2023年，2月20日，星期一对-香豆酸酶促棕色化反应的过程：

对-香豆酸（对羟基苯基丙烯酸

），是一元酚，在氧化为相应的邻醌之前，先在酚羟化酶的作用下，发生羟基化反应。之后的反应过程与儿茶酚相同，对－香豆酸由于开始发生的羟基化作用较慢，所以酶促棕色化反应的速度不如二元酚快。

第68页，共92页，2023年，2月20日，星期一氨基酸的酶促棕色化反应过程以酪氨酸为例：第69页，共92页，2023年，2月20日，星期一（2）酶促棕色化反应对烟叶烘烤质量的影响色泽——烘烤过程中烟叶内发生的酶促棕色化反应，依反应程度不同，烟叶的局部或全部会呈现出深浅不同的杂色，甚至使整片烟叶基本色丧失，造成烟叶挂灰、糊片、黑糟等现象。内在品质——烘烤期间酶促棕色化反应的发生，是造成烟叶中多酚类物质含量大幅度下降的原因之一。研究发现，一旦烟叶颜色完全变褐，多酚类物质含量就会减少85%，烟叶的芳香吃味因此而变差，杂气加重。物性——酶促棕色化反应还会使烟叶叶片变薄，重量减轻，弹性变差，破碎度加大，燃烧力减弱，最终将造成烟叶的可用性降低或者完全失去使用价值。第70页，共92页，2023年，2月20日，星期一3）酶促棕色化反应发生的条件

在正常的烘烤过程中，酶促棕色化反是很少发生的，烟叶棕色化变褐的程度也极其微小，对烟叶质量的影响效应并不显著。当烘烤技术条件不当时，将会诱导酶促棕色化反应剧烈发生。美国哈斯勒(F.J.Hassler)在研究烤烟烟叶变黄期因加热诱导的氧化变褐试验中发现，在烘烤温度为57℃时，仅6min时间棕色化反应过程就可全部完成。第71页，共92页，2023年，2月20日，星期一（1）诱导酶促棕色化反应发生的外部条件

诱导烟叶酶促棕色反应的外部条件有二：一是烘烤温度，二是烤房内空气的相对湿度。两者结合影响烟叶含水量和叶内多酚氧化酶的活性，从而制约酶棕色反应的发生。科学研究和实践证明，在转火定色时，酶促棕色化反应极易发生。

第72页，共92页，2023年，2月20日，星期一

若变黄初期烟叶的温度较高(高于42℃)，在高温条件下，由于叶内水分含量多，呼吸作用强烈，烟叶变褐在43℃时就会开始；即使正常成熟的烟叶，在环境温度45～46℃，空气相对湿度在60%以上时，烟叶失水量如果少于50%也会导致酶促棕色化反应的发生；相反，即使鲜烟叶水分较高，在此温度范围内，只要环境相对湿度控制60%在以下，烟叶的失水量不小于50%，则酶促棕色反应就不容易发生。说明环境湿度以及烟叶含水率对酶促棕色化反应有一定影响。第73页，共92页，2023年，2月20日，星期一（2）诱导酶促棕色化反应的内部因素①变黄期内烟叶的失水量

在变黄结束时，烟叶水分含量的多少是决定酶促棕色化反应能否发生的先决条件。多数试验结果认为，变黄期至定色前期温、湿度条件控制不当，烟叶失水量小于50％，就为酶促棕色化反应的发生奠定了基础；

第74页，共92页，2023年，2月20日，星期一②烟叶组织细胞结构和破坏程度

在烘烤的变黄期，烟叶中起催化作用的多酚氧化酶等酶类物质与其作用底物——多酚类物质由于分别位于细胞的不同区域，两者难以接触。因此，酶促棕色化反应也就不易进行。当烟叶变黄结束之后，细胞结构遭到破坏，原生质结构解体，叶组织的生命活性趋于死亡(一般烟叶致死温度为50～52℃)。导致细胞汁液大量外渗，原子氧自由进入叶组织，激发了多酚氧化酶的活性，创造了良好的氧化条件；

另一方面由于细胞原生质结构的解体，细胞内区隔被破坏，原来束缚于液泡中的多酚氧化酶得以与多酚类物质结触，使多酚类物质迅速氧化形成醌类物质。第75页，共92页，2023年，2月20日，星期一③烟叶中多酚氧化酶的活性变化及其影响因素

烟叶的酶促棕色化反应是在多酚氧化酶的催化作用下发生的。因此，多酚氧化酶的活性及其在烘烤过程中的变化也就成为烟叶棕色化变褐与否的决定因素。烟叶中多酚氧化酶的活性及其变化除决定于烟叶自身素质外，还受着环境温度、水分、pH值，以及抑制剂、激活剂的影响。第76页，共92页，2023年，2月20日，星期一a.不同素质鲜烟叶中多酚氧化酶的活性不同素质的鲜烟叶中多酚氧化酶活性有很差异。——随着烟叶成熟度提高，多酚氧化酶(PPO)活性呈下降趋势。——据测定，中等肥水条件下正常落黄成熟的鲜烟叶中，多酚氧化酶活性较低，常在0.2mg/min·g以下；而在高水肥条件下所形成的叶片肥大、水分含量高的烟叶以及非正常落黄的烟叶当中，多酚氧化酶活性往往较高，一般都在0.3mg/min·g以上。

第77页，共92页，2023年，2月20日，星期一b.烘烤温度对多酚氧化酶活性的影响

烘烤的环境温度不同，烟叶的多酚氧化酶活性强弱的表现也不同。据研究，烟叶中多酚氧化酶在40℃以下时是相当稳定的，最终表现出高活性；当温度在55℃以上时，就会迅速钝化失去活性。c.环境pH值对多酚氧化酶活性的影响随pH值逐渐增加，多酚氧化酶活性逐渐增强，当pH值达到6时，多酚氧化酶活性达到高峰，之后随pH值的继续增加，酶的活性又逐渐减弱。第78页，共92页，2023年，2月20日，星期一4）烘烤过程中酶促棕色化反应的调控（1）采用科学的调制方法是实现烟叶酶促棕色化反应调控的基础科学研究和生产实践证明，鲜烟叶只有采用低温慢烤的优质烟叶烘烤工艺，正确控制环境的温湿度条件，保持烟叶的环境温度与变黄程度和失水干燥程度同步，才有利于合理调控多酚氧化酶的活性。

控制好烟叶变黄的温、湿度条件，使烟叶在36～38℃条件下实现充分变黄，当烟叶变黄程度达到90%～100%，叶片塌架发软，黄片青筋，才能适时转火定色。第79页，共92页，2023年，2月20日，星期一（2）