细胞培养中的研究方法课件

细胞培养中的研究方法内容提要一、细胞生长状况观察二、细胞活力测定三、细胞凋亡检测四、流式细胞术五、常用单细胞分离技术一、细胞生长状况观察1.常规观察2.细胞计数3.细胞生长曲线4.细胞分裂指数5.细胞贴壁率6.细胞周期2.细胞计数血球计数板计数法电子计数仪计数法细胞数/ml＝（4大格细胞总数/4）×104×稀释倍数血球计数板计数法电子计数仪计数法原理：台盼蓝排斥法。再结合CCD成像，快速准确完成细胞计数和存活率计数。电子计数仪计数结果3.细胞生长曲线实验用细胞必须生长特征稳定，可采用细胞计数法测定并绘制细胞生长曲线来观察细胞状态。方法：①取生长状态较好细胞接种24孔板，每天或隔天计数（3个复孔），计数1-2周，以细胞数对时间作图绘制生长曲线。②用MTT法测定96孔板中细胞生长细胞倍增时间：细胞数量增加一倍所需时间。作图法：直接从图上找出公式法:lg2DT=tlgNt-lgNoNt:培养t时间后细胞数No:首次计数，一般接种24h进行5.细胞贴壁率6.细胞周期：同位素标记、流式细胞仪二、细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。（1）平板克隆形成试验适用于贴壁生长的细胞（肿瘤、正常）方法步骤：1.制备单细胞悬液2.接种细胞：倍比稀释后接种于培养皿，每皿接50、100、200等梯度，轻摇（十字方向）使细胞分布均匀。3.培养：2-3周4.染色：甲醇固定、吉姆萨染液染色5.计数：肉眼或显微镜（2）软琼脂克隆形成试验适用于悬浮细胞方法步骤1.制备单细胞悬液，103/ml2.制备底层琼脂：50℃5%琼脂以1：9和37℃新鲜培养基混合均匀铺入24孔板，每孔1ml，室温凝固3.50℃5%琼脂以0.6：9.4和细胞悬液混合，加入上述24孔板，每孔1ml。调节细胞数，一般每孔25、50、100个4.培养2-3周5.计数，计算克隆形成率注意事项：1.细胞充分分散2.平板试验培养早期勿晃动平皿、软琼脂试验培养液与琼脂液混匀。3.防治污染缺点：难获得真正单细胞悬液有些肿瘤细胞集落形成率低确定集落有一定难度耗时长，重复性差3.四唑盐（MTT）比色法测定细胞存活和生长。快速、简单、灵敏度高三、细胞凋亡检测1.形态学观察2.电泳法3.原位切口末端标记法（TUNEL）4.流式细胞术测定法1.形态学观察注意：1.提DNA时细胞数勿太多，否则酶解不全，DNA液粘稠2.尽量用去尖头的枪头吸取DNA液，防止人为剪切3.低电压电泳，利于DNA分离200bp400bp600bp800bp3.原位切口末端标记法（原位细胞凋亡检测，TUNEL）原理：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶使核小体内DNA断裂出现缺口，产生一系列3‘-OH末端。生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下与3‘-OH末端连接，并与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，加入DAB显色底物可在原位出现棕沉淀，镜下即可观察和计数着色细胞；正常或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。组织样本和细胞样本（细胞涂片）均可检测。

优点：对完整凋亡细胞进行原位染色，能准确反应凋亡细胞典型的生化和形态特征，极少量的凋亡细胞也可被检测出来，灵敏度高于染色法和DNALadder，应用广。注意：1.设好阳性及阴性对照，控制好药物处理时间2.TDT酶与生物素-dUTP混合液现用现配3.DAB显色时间勿过长4.细胞爬片操作要轻柔4.流式细胞术测定法(详见下节)四、流式细胞术20世纪70年代出现。特点：在单细胞水平上对大量细胞作准确快速分析和分选。应用：1.判断细胞体积、DNA含量、蛋白含量、酶活性、细胞膜受体、表面抗原等。2.无菌状态下，对活细胞分类收集，纯度达99%。流动室、液流系统激光光源光学系统光电管、检测系统计算机、分析系统工作原理：1.检测单细胞不同指标经荧光染色的单细胞悬液在气体压力下进入流动室，在鞘液约束下细胞排成单列从喷嘴喷出，形成细胞流。其与激光束垂直相交，细胞被激发出荧光，经光学系统收集后，传给计算机系统储存、分析并显示。用不同单克隆抗体或荧光染料，可对一个细胞同时进行多个参数检测。当细胞液滴逐个通过激光束时，干涉检测器被激活，而带荧光标记的细胞同时也使荧光检测器激活，液滴充电信号使液滴带上负电荷，从而向正极移动，进入荧光标记细胞收集器，纯度达99%以上。无菌状态下进行时，得到细胞仍可继续体外培养，进行后续研究。2.细胞分选流式细胞仪使用1.调试和校准：激光强度、液流速度、光路等、由专业技术人员进行。2.仪器操作：①打开细胞仪②打开联机电脑③在气压阀减压状态下确认鞘液桶充满并保证管路通畅④气压阀加压排出管路气泡⑤样品管加去离子水冲洗喷嘴系统⑥预热5-10min开始试验完毕后去离子水冲洗⑦分析结果常规样品制备方法1.直接荧光标记法：

直接用荧光素（FITC、PE等）标记的抗体处理细胞，进行检测（可同时加入几种不同荧光标记的抗体）。此法操作简单，结果准确，易于分析。2.间接荧光标记法：细胞先与一抗结合，再加荧光标记的二抗检测。此法费用低，但特异性差（二抗多为多克隆抗体），应设好阴阳对照。不适合细胞数少的标本测定。应用实例1.检测细胞膜受体原理：细胞表面保留有完整的抗原，用荧光标记的特异性抗体与细胞表面抗原结合，依荧光强度或阳性百分率可知相应抗原密度。步骤：①对数期细胞单细胞悬液，PBS洗涤，调浓度为1×107个/ml；②取100ul，加血清封闭；③加抗原避光孵育20min，PBS洗涤2次；④弃上清，用固定液固定细胞；⑤检测检测结果注意事项1.上机前细胞浓度1×106个/ml，过高或低均影响结果2.设立对照3.抗体孵育后充分洗涤，轻柔混匀，低速离心，以减少重叠细胞和细胞碎片4.孵育时避光2.同时检测细胞内外抗原原理：先标记膜抗原，固定后用破膜剂或打孔剂将胞膜破坏，再标记胞内抗原，测定阳性百分率。注意：抗原用不同荧光标记设立阴性对照避光操作原理：碘化丙啶（PI）可与胞内DNA及RNA结合，用RNA酶消化后，PI的荧光强度反应胞内DNA含量。因细胞周期各时相的DNA含量不同，故区分出来。G1/G0：二倍体细胞DNA含量（2N）G2/M：4NS：二者之间凋亡细胞总DNA含量降低，在G1/G0细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现二倍体峰，即凋亡细胞群。3.细胞周期及凋亡检测方法步骤：1.收集不同方法或药物处理的细胞，70%冷乙醇固定20min，4℃放置（最长4周）2.PBS清洗两次出去固定液，PBS调细胞浓度为2×107个/ml3.加入RNaseA消化半小时，加入PI，4℃避光20min4.检测检测结果：注意事项：1.细胞收集后及时固定，防止自溶或DNA降解2.要用对细胞穿透性强的固定剂，一般70%乙醇3.上机检测前细胞浓度要足够，一般1×106个/ml，杂质、碎片和重叠细胞<2%（可用合适目数筛子过滤）4.反应的凋亡结果应考虑的因素：DNA含量降低或DNA结构改变使DNA可染性降低。原理：正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在胞膜脂质双层内侧，细胞凋亡早期，PS翻转到膜外。膜联蛋白V（Annexin-V）是一种磷脂结合蛋白，可与PS特异性结合，检测早期凋亡细胞。以荧光素FITC标记的Annexin-V作探针，配合PI，可用流式细胞仪将凋亡早期。凋亡晚期及死细胞区分开。

4.细胞凋亡和坏死检测方法步骤：1.收集不同方式或药物处理的细胞，调整浓度为1-5×1072.预冷结合缓冲液（可置冰上）洗涤两次（1000r/min,5min）3.用250ul结合缓冲液重悬，使细胞浓度为1×1074.取100ul置于流式样品管，加5ulAnnexin-V和PI，避光孵育15min5.加入400ulPBS，选择合适波长测定正常细胞：V（-）PI（-）早期凋亡：V（+）PI（-）

晚期凋亡或坏死：V（+）PI（+）依据：正常细胞和早期凋亡细胞胞膜完整，故PI拒染；正常活细胞PS不外翻，故Annexin-V拒染，胞膜完整，PI拒染；晚期及坏死细胞膜受损，PS外翻，二者均染色结果判定：检测结果：I：晚期凋亡细胞II：早期凋亡细胞III：活细胞IIIIII注意事项：1.操作中动作轻柔，低速离心，勿用力吹打细胞，尽量冰上操作2.与荧光染料反应完尽快检测，1h后荧光衰减3.AnnexinV-FITC和PI是光敏物质，操作时避光4.试剂作用时间的影响5.PI能透皮吸收，勿直接接触5.凋亡细胞内游离Ca离子浓度检测原理：细胞凋亡时细胞内Ca离子浓度急剧升高。Ca离子荧光指示剂Fluo-3/Am与细胞内Ca离子特异结合，当用488nm激发光激发时，荧光强度与细胞内游离Ca离子浓度成正比。方法（略）五、常用单细胞分离技术指从细胞群体中分离出一个细胞使其在体外繁殖成新的细胞群体。用于细胞纯化及比较不同亚群的形态和功能。方法：有限稀释法、平皿克隆分离法、软琼脂克隆分离法。1.有限稀释法方法：细胞梯度倍比稀释，接种于微孔培养板，培养一段时间后，分离细胞克隆。用途：细胞同质化、分离耐药或突变细胞株、分离单克