生殖细胞培养

生殖细胞培养第1页，共109页，2023年，2月20日，星期一第2页，共109页，2023年，2月20日，星期一第八章生殖细胞培养第一节花药和花粉的培养第二节子房胚珠的培养第三节离体受精第四节胚培养第五节胚乳培养第3页，共109页，2023年，2月20日，星期一第一节花药与花粉培养第4页，共109页，2023年，2月20日，星期一第一节花药和花粉的培养1.花药培养和单倍体育种2花药培养技术3单倍体植株的二倍化第5页，共109页，2023年，2月20日，星期一1.花药培养和单倍体育种

单倍体细胞(haploidcell)：植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半。花粉和花药的培养(pollenandantherculture)是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。第6页，共109页，2023年，2月20日，星期一第一节花药和花粉的培养1.花药培养和单倍体育种2花药培养技术3单倍体植株的二倍化第7页，共109页，2023年，2月20日，星期一花药培养是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。第8页，共109页，2023年，2月20日，星期一花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。油菜成熟花药的结构花粉囊花粉囊壁成熟花粉粒第9页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.1花粉和花药培养的基本程序2.2影响花药诱导频率的因素2.3产生花粉植株的两条途径

2花药培养技术第10页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.1花粉和花药培养的基本程序外植体花蕾预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养2花药培养技术第11页，共109页，2023年，2月20日，星期一1）预处理:低温冷藏是最常用的方法2）表面消毒3）接种4）培养形成花粉植株。

花粉---愈伤组织---苗花粉---胚状体---苗

2.1.1花药培养过程：第12页，共109页，2023年，2月20日，星期一

花药培养方法---水稻旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍剥去旗叶鞘取出稻穗10％漂白粉10min无菌水洗一次。70％酒精手洗两遍培养5天后，花药变黑褐色，20天花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。用接种环接种到培养基上左手持穗，右手用镊子取出花药至无菌培养皿中第13页，共109页，2023年，2月20日，星期一花药培养脱毒1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；花药采取时期单核期：花蕾4-6mm，花药1mm花药诱导愈伤组织培养基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L增殖分化培养基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L第14页，共109页，2023年，2月20日，星期一草莓花药愈伤组织,再生植株,花药植株第15页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.1.2花粉培养花粉培养成苗途径与花药培养比较:相同点：胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径不同点：花粉培养：

需进行花粉的分离特殊的花粉诱导培养第16页，共109页，2023年，2月20日，星期一花粉培养过程取花蕾（镜检）预培养数天取花药消毒分离花粉接种培养愈伤组织发生第17页，共109页，2023年，2月20日，星期一注意：操作过程中注意不要损伤花药，不要直接夹花药，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。第18页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.1花粉和花药培养的基本程序2.2影响花药诱导频率的因素2.2.1材料的来源2.2.2花粉发育阶段的选择2.2.3花药供体植株的生长条件2.2.4培养基2.2.5低温预处理2.3产生花粉植株的两条途径2花药培养技术第19页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.2.1材料的来源大田材料比温室的好，因为大田生长的材料一般生长比较健壮，发育好。光强和日照时数也会影响花药培养效率。2.2影响花药诱导频率的因素第20页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.2.2花粉发育阶段的选择选取花粉处于合适发育期的花药，以便离体培养后能启动花粉发育。第21页，共109页，2023年，2月20日，星期一第22页，共109页，2023年，2月20日，星期一第23页，共109页，2023年，2月20日，星期一花粉发育时期：适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)营养细胞生殖细胞精子第24页，共109页，2023年，2月20日，星期一花粉发育时期的检测：外部形态观察：在水稻中，一般叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2时，可能为单核靠边期的花粉。压片染色法：是检测花粉发育时期的简便有效方法，常用染色剂为醋酸洋红。第25页，共109页，2023年，2月20日，星期一花粉发育时期培养花药数胚状体（%）单核早期单核靠边（中）单核靠边（晚）双核早双核晚157721633007.819.41.590烟草花粉发育时期对胚状体诱导率的影响第26页，共109页，2023年，2月20日，星期一烟草花药培养的最适取样期：花粉为单核期的花蕾，此时花蕾的花冠与萼片等长。芦笋花药培养的最适取样期也是单核期的花粉，花蕾长为2-2.5mm。镜检确定花粉的发育时期：用醋酸洋红或碘化钾染色，压片镜检，找出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系。花粉发育的适宜阶段因植物不同而不同。第27页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.1花粉和花药培养的基本程序2.2影响花药诱导频率的因素2.2.1材料的来源2.2.2花粉发育阶段的选择2.2.3花药供体植株的生长条件2.2.4培养基2.2.5低温预处理2.3产生花粉植株的两条途径2花药培养技术第28页，共109页，2023年，2月20日，星期一

2.2.3花药供体植株的生长条件选取主穗（一级侧枝）的花蕾，发育良好，数量大，发育同步。水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高，同步化程度高。第29页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.2.4培养基

（1）基本培养基：MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养；B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养；N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养。我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6特点：铵离子浓度较低。第30页，共109页，2023年，2月20日，星期一2）激素种类和浓度

细胞分裂素可促进胚状体形成；

生长素可诱导愈伤组织形成。

细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗第31页，共109页，2023年，2月20日，星期一激素种类和浓度禾本科植物中，常用1-5mg/L2,4-D或NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。第32页，共109页，2023年，2月20日，星期一3)糖烟草的最适蔗糖浓度为3％，水稻为3％-6％，玉米则为12％-15％。4）活性炭较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。第33页，共109页，2023年，2月20日，星期一

培养的条件：光照(12~18h，5,000~10,000lx，28℃)黑暗(12-16h，22℃)周期交替进行。第34页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.1花粉和花药培养的基本程序2.2影响花药诱导频率的因素2.2.1材料的来源2.2.2花粉发育阶段的选择2.2.3花药供体植株的生长条件2.2.4培养基2.2.5低温预处理2.3产生花粉植株的两条途径2花药培养技术第35页，共109页，2023年，2月20日，星期一处理天数接种花药（枚）发生愈伤组织的花药发生胚状体的花药枚%枚%对照51015202584872390284647043458918530.591.111.002.131.060.69812155230.941.661.660.590.430.69低温（3℃）处理对四季橘花药愈伤组织和胚状体形成的影响2.2.5低温预处理第36页，共109页，2023年，2月20日，星期一第37页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.1花粉和花药培养的基本程序2.2影响花药诱导频率的因素2.3产生花粉植株的两条途径2花药培养技术第38页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.3产生花粉植株的两条途径花粉花粉胚状体愈伤组织从芽从芽生根移栽脱分化分化再分化诱导第39页，共109页，2023年，2月20日，星期一第40页，共109页，2023年，2月20日，星期一第一节花药和花粉的培养1.花药培养和单倍体育种2花药培养技术3单倍体植株的二倍化3.1自发加倍3.2人工加倍3.3从愈伤组织再生第41页，共109页，2023年，2月20日，星期一3单倍体植株的二倍化3.1自发加倍

自发加倍的频率在不同的植株上不同。烟草自发加倍的频率低，约1%～2%。水稻自然加倍的频率高达70%以上。优点：不会出现核畸变，缺点：加倍频率极低；第42页，共109页，2023年，2月20日，星期一3.2人工加倍用秋水仙碱处理单倍体可使加倍频率提高。较大浓度的秋水仙素溶液处理单倍体植株，时间为24-96h。浸泡试管苗方法、处理芽方法、浸根方法第43页，共109页，2023年，2月20日，星期一3.3从愈伤组织再生把单倍体植株的茎、叶柄或根的节段，诱导形成愈伤组织，把这种愈伤组织转移到分化培养基上，在再生植株中将出现许多二倍体植株。第44页，共109页，2023年，2月20日，星期一4花药和花粉培养的应用

----单倍体植株育种

单倍体植物的特点:A、体细胞染色体数减半；B、生长发育弱，体形小，各器官明显减小；C、雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。第45页，共109页，2023年，2月20日，星期一单倍体植物的优点:1）利于得到纯合体——单倍体加倍、后代形状一致，利于加快纯合的二倍体的筛选时间。2）直接从杂交的优良品系的花粉培养筛选，减少优良品系筛选时间3）有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。4）获得无病毒个体。第46页，共109页，2023年，2月20日，星期一第八章生殖细胞培养第一节花药和花粉的培养第二节子房和胚珠的培养第三节离体受精第四节胚培养第五节胚乳培养第47页，共109页，2023年，2月20日，星期一第二节子房胚珠的培养1子房培养2胚珠培养3影响子房和胚珠培养的因素4子房胚珠的培养应用第48页，共109页，2023年，2月20日，星期一子房壁果皮珠被种皮胚乳胚受精极核受精卵种子果实子房的结构第49页，共109页，2023年，2月20日，星期一雌蕊与子房的类型第50页，共109页，2023年，2月20日，星期一1子房培养定义：子房培养是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。类型授粉子房的培养未授粉子房的培养第51页，共109页，2023年，2月20日，星期一（1）子房培养的培养过程1)制备外植体：在开花前后适宜时期取子房或幼花，消毒2)子房培养：固体或液体培养均可（2）培养基:N6,MS第52页，共109页，2023年，2月20日，星期一性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）----胚状体或愈伤组织----单倍体植株；体细胞（珠被、子房壁）---胚状体或愈伤组织----二倍体植株；（3）培养子房的发育：第53页，共109页，2023年，2月20日，星期一第二节子房胚珠的培养1子房培养2胚珠培养3影响子房和胚珠培养的因素4子房胚珠的培养应用第54页，共109页，2023年，2月20日，星期一定义：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。倒生胚珠2胚珠培养第55页，共109页，2023年，2月20日，星期一胚珠培养类型：1)受精胚珠的培养2)未受精胚珠的培养示胚珠的位置第56页，共109页，2023年，2月20日，星期一（2）培养基：White,Nitsch,MS（3）胚珠的发育：A受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织B未受精胚珠：形成单倍体植株。（1）胚珠培养的基本过程：第57页，共109页，2023年，2月20日，星期一第二节子房胚珠的培养1子房培养2胚珠培养3影响子房和胚珠培养的因素4子房胚珠的培养应用第58页，共109页，2023年，2月20日，星期一3影响子房和胚珠培养的因素3.1基因型---品种间的差异3.2生理状态---决定于环境状态温度、光强、日长、植物营养状况、环境胁迫等。

3.3胚囊发育时期：以八核胚囊和成熟胚囊期的子房培养具有较高的诱导频率。第59页，共109页，2023年，2月20日，星期一3.4培养基

（1）基本培养基不同培养基对于子房培养产生愈伤组织的诱导率有直接影响，常用培养基是N6、BN、MS，禾本科作物以N6培养基较常用，其它植物则多用MS和BN。第60页，共109页，2023年，2月20日，星期一（2）植物激素的影响

未授粉的子房培养必须加入适宜种类和浓度的植物激素

百合未授粉子房培养2,4-D单独使用诱导频率为18.87%2,4-D＋6-BA诱导频率为33.73%2,4-D＋KT诱导频率为47.76%第61页，共109页，2023年，2月20日，星期一（3）蔗糖浓度

蔗糖浓度多在3～10％之间，不同植物材料而异，诱导培养阶段蔗糖浓度高，分化培养时蔗糖浓度低。第62页，共109页，2023年，2月20日，星期一3.5接种方式

极性；营养吸收花柄直插比平放效果好第63页，共109页，2023年，2月20日，星期一第二节子房胚珠的培养1子房培养2胚珠培养3影响子房和胚珠培养的因素4子房胚珠的培养应用第64页，共109页，2023年，2月20日，星期一4子房胚珠的培养应用挽救杂种胚，促进原胚继续生长，使杂种幼胚发育成熟；成功：四季桔、柑、凤仙花、洋葱成功的植物：西葫芦、莴苣、百合等未授粉胚珠和子房，诱导孤雌生殖，产生雌性单倍体第65页，共109页，2023年，2月20日，星期一第八章生殖细胞培养第一节花药和花粉的培养第二节子房胚珠的培养第三节离体受精第四节胚培养第五节胚乳培养第66页，共109页，2023年，2月20日，星期一第三节离体受精1离体受精(invitrofertilization)

从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称为离体受精，或试管受精。

第67页，共109页，2023年，2月20日，星期一离体受精的意义离体受精技术在克服自交不亲和性与远缘杂交障碍，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后不能进入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合方面有着极其重要的意义。另外，试管受精技术也为外源特异基因的有性转移，诱导遗传变异开辟了一条新途径。

第68页，共109页，2023年，2月20日，星期一2离体受精的方法2.1收集花粉

参照花粉培养2.2剥取子房或胚珠做母本的花蕾在开花前数天去雄并套袋，开花前一天取花蕾进行常规表面消毒，在无菌条件下剥取胚珠（带胎座或不带胎座）或子房培养。第69页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.3离体受精2.3.1子房试管受粉

人工方法把花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发并完成受精过程。①直接引入法：把花粉悬浮液直接滴入子房切口后进行培养。②注射法：无菌注射器吸取花粉悬浮液，接种于培养基上。第70页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.3.2胚珠试管受粉胚珠剥离后可以从胎座上切下单个胚珠授粉，也可将带着完整胎座或部分胎座的胚珠接种到培养基上，并撒播花粉。第71页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.3.3精卵细胞融合法分离精子细胞：渗透压冲击法、酶解法、挤压研磨法等；分离卵细胞：酶解法、解剖法等精卵融合：电融合法、PEG法等第72页，共109页，2023年，2月20日，星期一3影晌离体授粉的因素外植体的发育阶段花粉粒数量及萌发力培养基授粉方式和接种方式保留母体组织的影响

第73页，共109页，2023年，2月20日，星期一第八章生殖细胞培养第一节花药和花粉的培养第二节子房胚珠的培养第三节离体受精第四节胚培养第五节胚乳培养第74页，共109页，2023年，2月20日，星期一第四节胚培养1胚培养2植物胚培养的类型3离体胚培养的发育途径4胚培养的应用第75页，共109页，2023年，2月20日，星期一1含义胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。第四节胚培养第76页，共109页，2023年，2月20日，星期一

胚培养的意义用于胚的挽救，促使发育不良或中途败育的胚发育成熟打破种子休眠,抢救储藏过久或储藏不当的种子。克服珠心胚的干扰

(多胚性植物－柑橘、芒果、蒲桃、仙人掌）诱导胚状体及胚性愈伤组织

种子生活力的快速测定

第77页，共109页，2023年，2月20日，星期一第四节胚培养1胚培养2植物胚培养的类型3离体胚培养的发育途径4胚培养的应用第78页，共109页，2023年，2月20日，星期一2植物胚培养的类型即成熟胚的培养和幼胚的培养。成熟胚：一般是指子叶期后至发育完全的胚，较易成功。幼胚：是指子叶期以前的具胚结构的幼小胚，培养技术难度较成熟胚大。第79页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.1成熟胚的培养（1）材料的消毒与接种健壮优良的个体自交种或杂交种子，常规消毒灭菌，剥离胚。（2）培养基大量元素和微量的无机盐为基本成分谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长植物天然浸提物（YE）促进胚生长硫氨素促进胚根的伸长生长素低浓度促进胚的发育（胚根）赤霉素促进有后熟作用的种子萌发（3）培养条件pH一般为5.2~6.312小时光照和25℃

，热带兰花杂交种胚30℃附加成分第80页，共109页，2023年，2月20日，星期一（4）成熟胚培养过程---以玉米成熟胚培养为例1）玉米种子消毒2）在黑暗条件下，将种子放在无菌湿润的含滤纸的培养皿中培育6hr。3）将吸涨的种子在无菌培养皿内将胚分离出来4）无菌水冲洗3次5）在MS培养基中暗培养。6）观察：2d出现胚根，3-4d出现胚芽，10d长成幼苗玉米成熟胚的培养第81页，共109页，2023年，2月20日，星期一2.2原胚(幼胚)的培养（1）

培养方法

①取材取材时期多为球形胚至鱼雷形胚②幼胚剥离一定要注意保湿，且操作要迅速。胚剥离时应带胚柄，胚柄促进幼胚离体生长。③培养条件的控制剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。第82页，共109页，2023年，2月20日，星期一取子房常规表面消毒解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。固体培养（2）幼胚培养过程：第83页，共109页，2023年，2月20日，星期一1)无机氮：2)渗透压：3)复杂的天然提取物：4)活性炭：包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；蔗糖，8%-10%，不同发育期，渗透压不一样，初期高。因为自然条件下，原胚被一层高渗液体包围着椰乳有促进幼胚生长和分化的作用吸附有毒物质（3）

原胚培养的条件第84页，共109页，2023年，2月20日，星期一5)环境条件

对于幼胚培养，初期弱光和黑暗更适宜，6)培养材料

植物培养材料的基因型和胚发育程度对离体胚培养有重要影响。第85页，共109页，2023年，2月20日，星期一7)有利幼胚培养的因素胚乳看护培养:利于原胚的生长有明显的促进作用。胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要：胚柄促进生长的活性，而且保留胚柄减少对胚的直接损失。第86页，共109页，2023年，2月20日，星期一第四节胚培养1胚培养2植物胚培养的类型3离体胚培养的发育途径4胚培养的应用第87页，共109页，2023年，2月20日，星期一3离体胚培养的发育途径按正常胚胎发育途径形成植株脱分化形成愈伤组织胚“早熟萌发”第88页，共109页，2023年，2月20日，星期一成熟胚未成熟胚维持胚的生长，进行正常的胚胎发育成熟，完成胚胎发育的全过程。正常发育形成小苗3.1按正常胚胎发育途径形成植株第89页，共109页，2023年，2月20日，星期一3.2脱分化形成愈伤组织离体胚小植株愈伤组织激素浓度高胚状体或不定芽分化培养基第90页，共109页，2023年，2月20日，星期一3.3胚“早熟萌发”畸形苗发育不正常而死未成熟幼胚分离变异体离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成幼苗。第91页，共109页，2023年，2月20日，星期一第四节胚培养1胚培养2植物胚培养的类型3离体胚培养的发育途径4胚培养的应用第92页，共109页，2023年，2月20日，星期一4胚培养的应用1)在远缘杂交育种中：克服杂种胚不能正常发育2)克服珠心胚的干扰，提高育种效率3)缩短育种周期4)测定休眠种子的萌发率5)理论研究中的应用第93页，共109页，2023年，2月20日，星期一第八章生殖细胞培养第一节花药和花粉的培养第二节子房胚珠的培养第三节离体受精第四节胚培养第五节胚乳培养第94页，共109页，2023年，2月20日，星期一第五节胚乳培养1胚乳培养2胚乳培养过程3影响胚乳培养的因素4胚乳再生植株的染色体倍性变异5胚乳培养的应用第95页，共109页，2023年，2月20日，星期一

胚乳：X＝3（2♀极核＋1♂精子）是营养组织，影响胚的发育。有些植物在胚发育过程中把胚乳消耗尽（豆科和葫芦科）有些植物，胚乳在成熟种子中存在，贮存大量营养物质（禾谷类，椰子，咖啡）第五节胚乳培养第96页，共109页，2023年，2月20日，星期一1.胚乳培养：将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。第97页，共109页，2023年，2月20日，星期一胚乳培养的意义胚乳培养再生植株证明了全能性理论；研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；再生植株多为三倍体，产生无籽果实；可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非整倍体植株。胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。第98页，共109页，2023年，2月20日，星期一由胚乳再生完整植株的物种12科，20多种。蔷薇科：苹果，梨，桃。禾本科：大麦、玉米和水稻。茄科：枸杞，马铃薯。第99页，共109页，2023年，2月20日，星期一第五节胚乳培养1胚乳培养2胚乳培养过程3影响胚乳培养的因素4胚乳