灭活剂保护剂与免疫佐剂

灭活剂保护剂与免疫佐剂第1页，共60页，2023年，2月20日，星期日本章内容第一节灭活剂第二节保护剂第三节免疫佐剂第2页，共60页，2023年，2月20日，星期日第一节灭活剂123灭活与灭活剂概念常用灭活剂的灭活机理与应用影响灭活作用的因素第3页，共60页，2023年，2月20日，星期日灭活与灭活剂一灭活:

是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗；或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。灭活剂:

用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活剂。第一节灭活剂灭活方法:

物理方法（不用），化学方法（常用）微生物毒力的灭活或毒素毒性灭活或补体活性灭活第4页，共60页，2023年，2月20日，星期日常用灭活剂的灭活机理与应用二甲醛溶液①蛋白质②核酸烷基化（不加中断剂）烷化剂苯酚结晶紫β-丙酰内酯使微生物核酸烷基化,灭活后加2%硫代硫酸钠中断灭活用于防腐，很少用于疫苗研制用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原病毒灭活剂，为狂犬病灭活苗制备所用.第一节灭活剂第5页，共60页，2023年，2月20日，星期日甲醛灭活机理：A第一节灭活剂

甲醛醛基氨基甲基胺

羧基亚甲基二醇单酯

巯基亚甲基二醇

羟基羟基甲酚第6页，共60页，2023年，2月20日，星期日甲醛灭活浓度：多数为0.1％～0.3％A第一节灭活剂灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的；必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。第7页，共60页，2023年，2月20日，星期日烷化剂灭活机制：B第一节灭活剂1.烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变DNA的结构而破坏其功能，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。2.与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。第8页，共60页，2023年，2月20日，星期日灭活时间灭活温度微生物种类和特性灭活剂特异性灭活剂浓度灭活PH值第一节灭活剂影响因素石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛最常用。具体不同病原体或毒素,其灭活时间和温度不一致.有机物存在第9页，共60页，2023年，2月20日，星期日第二节保护剂（稳定剂）123保护剂概念及用途保护剂的分类影响保护效能的因素4常用的冻干保护剂（稳定剂）5兽医生物制品常用的保护剂第10页，共60页，2023年，2月20日，星期日第二节保护剂（稳定剂）一、保护剂

又称稳定剂（stabilizer），是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、血清制备等）第11页，共60页，2023年，2月20日，星期日保护剂用途不同用途加不同保护剂,主要针对活的微生物或细胞。菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO)DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方）第二节保护剂（稳定剂）干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖第12页，共60页，2023年，2月20日，星期日二、保护剂的分类根据作用机理渗透剂:如二甲基亚砜(DMSO),甘油和蔗糖等.非渗透剂:如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等.根据分子量大小高分子物质低分子物质根据化学性质复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物第二节保护剂（稳定剂）第13页，共60页，2023年，2月20日，星期日

复合物脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等糖类蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等盐类乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等醇类山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸类柠檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等一些常用的冷冻干燥保护剂分类保护剂第二节保护剂（稳定剂）第14页，共60页，2023年，2月20日，星期日冻干保护剂作用组成1.营养液3.抗氧化剂第二节保护剂（稳定剂）2.赋形剂可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状。防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响，使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度。抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。第15页，共60页，2023年，2月20日，星期日冻干保护剂作用机制1、防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生物活性物质的损伤；第二节保护剂（稳定剂）2、降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保持细胞的活力；3、保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复苏和迅速修复自身。第16页，共60页，2023年，2月20日，星期日配制方法:糖类不能用121℃高压灭菌处理。种类:根据微生物种类或者用途来添加不同种类保护剂。浓度：严格按照配方执行。酸碱度(PH值):主要对M的影响。1234第二节保护剂（稳定剂）三、影响保护剂效能的因素第17页，共60页，2023年，2月20日，星期日①需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、

1.5％明胶；

②厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱脂乳或7.5％葡糖血清。

注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。不同种类微生物需要添加不同保护剂

（一）细菌的保护剂四、常用的冻干保护剂(稳定剂)第二节保护剂（稳定剂）第18页，共60页，2023年，2月20日，星期日、（二）病毒的保护剂四、常用的冻干保护剂(稳定剂)

①5%蔗糖脱脂乳；②马立克814活细胞疫苗:保存液氮.稳定剂为10%二甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。注:微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有不同的配方。第二节保护剂（稳定剂）第19页，共60页，2023年，2月20日，星期日五、兽医生物制品常用的保护剂1.5%蔗糖脱脂乳蔗糖(或乳糖)5g,加脱脂乳至100ml,充分后,110~116℃高压灭菌30~40min.3.SPGA保护剂蔗糖76.62g、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠0.83g、牛血清白蛋白10g、加去离子水至1000ml，混合溶解,过滤除菌。

2.根据化学性质明胶:2%-3%(g/m1)、蔗糖5%(g/m1)、硫脲1%-2%(g/m1)。先将12%-18%明胶液、30%蔗糖液和6%-12%硫脲液加热溶解，116℃高压灭菌30~40min；

第二节保护剂（稳定剂）第20页，共60页，2023年，2月20日，星期日一、佐剂概念与作用机理1.佐剂(新):凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质。2.佐剂(旧):当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质.

以前作为佐剂使用时没有免疫原性,但现在有所改变,如IL-2佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不一样,具有免疫调节和免疫增强作用,单独使用时却具有免疫原性。注意:佐剂和免疫增强剂的关系?

有时佐剂也是免疫增强剂.第三节免疫佐剂第21页，共60页，2023年，2月20日，星期日一、佐剂概念与作用机理3.作用特点1)明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答。2)用最少的抗原和最少的接种次数，产生足够的免疫应答。第三节免疫佐剂第22页，共60页，2023年，2月20日，星期日一、佐剂概念与作用机理4.作用方式1）改变正常免疫机能,吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原.2）改变抗原构型,使抗原物质降解,并加强其免疫原性；3）延长抗原在组织内的贮存时间,使抗原缓慢降解和缓释,并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，T细胞与B细胞）。第三节免疫佐剂第23页，共60页，2023年，2月20日，星期日一、佐剂概念与作用机理5.作用机理1）抗原递呈（antigenpresentation）2）抗原寻的（antigentargeting）3）免疫调节（immunemodulation）第三节免疫佐剂第24页，共60页，2023年，2月20日，星期日1)抗原递呈:指抗原分子递呈给T细胞的方法。第三节免疫佐剂佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。第25页，共60页，2023年，2月20日，星期日2)抗原寻的:指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等有重要作用。第三节免疫佐剂3)免疫调节:

是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制.通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度.T细胞有Th1和Th2两个亚类.同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应.因此,通过筛选特定的佐剂,可以达到诱导正确的免疫应答的目的。第26页，共60页，2023年，2月20日，星期日第三节免疫佐剂第27页，共60页，2023年，2月20日，星期日1.按物理性质颗粒型佐剂非颗粒型佐剂2.按生物学性质微生物及其组分非微生物物质3.按佐剂在体内存留的时间贮存型佐剂（depottypeadjuvant）非贮存型（non-depottypeadjuvant）二、佐剂的分类第三节免疫佐剂第28页，共60页，2023年，2月20日，星期日第三节免疫佐剂1．盐类佐剂氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。2．油水乳剂佐剂弗氏完全佐剂（Freund’scompleteadjuvant,FCA）弗氏不完全佐剂（FIA）和矿物油白油佐剂。3．免疫刺激复合物佐剂（ISCOM）4．蜂胶佐剂（propolis）5．脂质体佐剂（liposomes）。6．其他：MF59佐剂、微囊化佐剂（micro-encapsulation)、硬脂酰酪氨酸佐剂和γ－菊粉等。（一）颗粒型佐剂第29页，共60页，2023年，2月20日，星期日第三节免疫佐剂（一）颗粒型佐剂1.盐类佐剂：氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。氢氧化铝胶合成方法:

（1）用铝粉加烧碱合成法

2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O

A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明矾加碳酸钠合成法

2KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2↑（3）用三氯化铝与氢氧化钠合成

A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl第30页，共60页，2023年，2月20日，星期日用铝粉加烧碱合成法：

2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O

A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O用铜纱筛滤过，用布袋脱水过夜，收存于容器内，可约得600kg铝胶。取氢氧化铝干粉50～55kg，加入6万毫升沸水中，搅拌均匀;倒入硫酸100kg，爆沸至棕褐色，经30～60min后，加温水，边加边搅拌约至总量为35万毫升；用前加水稀释至100万毫升，温度约为80℃，盛装在一个缸内另一缸盛80kg烧碱，加水至100万毫升，加温至75℃两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内，蒸汽吹沸熟化10min，调节pH6.9土0.1，继续熟化3min，稳定pH6.9土0.1静置沉淀，弃上清后加入约5倍量软化水，搅拌洗涤、弃上清，如此3～5次，检查至硫酸盐合格为止。第三节免疫佐剂第31页，共60页，2023年，2月20日，星期日注意事项氢氧化铝吸附力较强，所以要用软化水或去离子水洗涤。氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要掌握好化合时的pH值。贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，严密封盖，贮放期不超过3个月。铝胶室温保存，以免破坏胶态。第三节免疫佐剂第32页，共60页，2023年，2月20日，星期日2.油水乳剂佐剂一种好的乳剂疫苗应是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒,混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系.被分散的物质称为分散相(内相),承受分散相的液体称连续相（外相），两相间的界面活性物质称为乳化剂。第三节免疫佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。第33页，共60页，2023年，2月20日，星期日天然乳化剂：阿拉伯胶、海藻酸钠、蛋黄以及炼乳乳化剂第三节免疫佐剂人工合成乳化剂离子型:阴离子类乳化剂：十二烷基磺酸钠和硬脂酸铝阳离子类乳化剂：氯化苯甲烃铵、溴化十六烷三甲基非离子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油酸脂、司本-80、吐温-80第34页，共60页，2023年，2月20日，星期日国内外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-47号或10号白油白油佐剂质量标准:

无色无味，50℃运动粘度7m2／s左右。紫外吸收A250-350＜0.1％，紫外消光系数＜12×108；单环芳烃与双环芳烃含量低于0.5％,无多环芳烃；小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，观察60d，表现正常。第三节免疫佐剂第35页，共60页，2023年，2月20日，星期日（1）剂在水中法：乳剂配方与乳化方法第三节免疫佐剂

将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。（2）剂在油中法：

将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5µm左右，比较稳定。第36页，共60页，2023年，2月20日，星期日免疫实验动物用的佐剂配制(1)弗氏佐剂：第三节免疫佐剂矿物油75%-85％，乳化剂15％-25%，混合后经除菌过滤而成为FIA；如向其中加入0.5mg／m1死结核杆菌即为FCA。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。

9份油和1份司本-80混合后加2％吐温-80和1％~2%硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与抗原水相1：1混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗.

(2)白油佐剂：第37页，共60页，2023年，2月20日，星期日大量生产乳剂疫苗油相:

94%白油.6%司本-80.1%-2%硬脂酸铝,灭菌；水相：抗原液加2％-4%吐温-80乳化：将油相与水相按3:1-2:1比例配制，先缓速混合，再通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2％吐温-80生理盐水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗。第三节免疫佐剂第38页，共60页，2023年，2月20日，星期日油乳剂检验（1）粘度测定:流出法、Saybolt粘度计法第三节免疫佐剂吸管内口直径为1.2mm，室温下吸满lml乳剂，垂直放出0.4ml所需时间作为粘度单位。（2）乳剂稳定性测定：①加速老化法：疫苗于37℃贮存10-30d不破乳。②离心加速分层法：3000rpm离心15min不分层，相当于保存1年以上不破乳。第39页，共60页，2023年，2月20日，星期日胰消化酶的作用3.免疫刺激复合物1)ISCOM由抗原物质与由皂树皮提取的一种糖苷QuilA和胆固醇按1:1:1混合后自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡。2)ISCOM直径40nm，每个ISCOM约含10～12分子的蛋白质。3)ISCOM应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生“全面”免疫应答的效力，可长期增强特异性抗体应答。4)ISCOM能有效地通过粘膜给药，从而可以用于抗呼吸道感染。5)目前，兽用ISCOM疫苗已在国外投放市场。第40页，共60页，2023年，2月20日，星期日供免疫佐剂用的蜂胶外观应具备其固有的特征是一种优良的天然药物具有广泛的生物活性和药理作用(抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎)4.蜂胶佐剂第三节免疫佐剂具有免疫增强作用

能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。

第41页，共60页，2023年，2月20日，星期日蜂胶佐剂疫苗制备方法（1）蜂胶的处理：A.蜂胶（4℃以下贮存）b.粉碎过筛c.按1:4(W/V)加95％乙醇,室温浸泡24～48hd.冷却,过滤或离心取上清e.透明栗色纯净蜂胶浸液,4℃以下保存备用f.除去干渣计算出浸液中含蜂胶量。

灭活菌液或病毒液，加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶10mg，边加边摇荡，成为乳浊状，即可。（2）蜂胶佐剂疫苗的制备：第三节免疫佐剂第42页，共60页，2023年，2月20日，星期日第三节免疫佐剂（二）非颗粒性佐剂1．肽类佐剂（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调节多肽。2．表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（TDM）3．核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、CpG4．含硫复合物类佐剂：左旋咪唑5．碳水化合物高分子类佐剂：香菇多糖、DEAE-葡聚糖6．细胞因子类佐剂（cytokine）：IL-2、IL-4和γ-IFN等。7．脂质分子类佐剂:脂多糖、VitA和VitE等脂溶性维生素8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。第43页，共60页，2023年，2月20日，星期日细胞因子类免疫佐剂细胞因子的概念

是机体的各种细胞在其生命周期中所释放的具有不同生物学效应的物质，是免疫细胞间相互作用的调节信号。该类物质相互诱生，相互影响，构成一个巨大的细胞因子网络（cytokinenetwork）系统，各种细胞借助自己所释放的细胞因子完成各自的功能，在免疫应答中发挥作用。第三节免疫佐剂1第44页，共60页，2023年，2月20日，星期日细胞因子类免疫佐剂细胞因子的分类1)经典的细胞因子：淋巴毒素（LT）肿瘤坏死因子（TNF）干扰素（INF）2)对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子：白细胞介素（IL）集落刺激因子（CSF）第三节免疫佐剂1第45页，共60页，2023年，2月20日，星期日第三节免疫佐剂第46页，共60页，2023年，2月20日，星期日第三节免疫佐剂第47页，共60页，2023年，2月20日，星期日细胞因子类免疫佐剂细胞因子作用特点1)多效性：①免疫调节作用的多样性②作用方式的非特异性：不表现抗原特异性2)靶细胞的多样性：构成机体细胞—细胞调节网络3)多源性：4)高效性：有免疫激素（immunehormone）之称5)快速反应性：即对激发因素的迅速反应第三节免疫佐剂1第48页，共60页，2023年，2月20日，星期日细胞因子类免疫佐剂细胞因子应用1)作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果。2)作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染。3)通过基因重组，构建新型基因工程疫苗IL-2-AIV-HA重组痘病毒。第三节免疫佐剂1第49页，共60页，2023年，2月20日，星期日细胞因子类免疫佐剂几种重要的细胞因子

1)白细胞介素-2（IL-2）

2)白细胞介素-4（IL-4）

3)白细胞介素-12（IL-12）4)γ-干扰素（IFN-γ）第三节免疫佐剂1第50页，共60页，2023年，2月20日，星期日盐酸、脂肪、高渗溶液白细胞介素-2(IL-2)刺激物为抗原或促有丝分裂原(ConA);T细胞分泌；无抗原特异性糖蛋白.含133aa,分子量15-35kDa;70℃30min及pH值2-9范围内稳定.1)第三节免疫佐剂第51页，共60页，2023年，2月20日，星期日盐酸、脂肪、高渗溶液白细胞介素-4(IL-4)

刺激物:抗原或丝裂原;由Th细胞产生分子量15～20kDa.有2～3个糖基化部位.140个氨基酸一种强有力的佐剂候选因子.2)第三节免疫佐剂第52页，共60页，2023年，2月20日，星期日盐酸、脂肪、高渗溶液白细胞介素-12(IL-12)

是目前发现的唯一主要由B细胞产生的细胞因子，与IL-2有协同作用，所以曾被称为细胞毒淋巴细胞成熟因子（CLMF）和天然杀伤细胞刺激因子（NKSF）。3)第三节免疫佐剂

糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）两个亚单位构成，两个亚单位完全由不同的基因所编码，只有结合为一个完整的分子时才能发挥生物学活性。

IL-12活性高于IL-2和IFN，在极低浓度时就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。

IL-12诱导产生的Th1应答反应尤为引人注目，可望用于主要诱导细胞免疫应答的疫苗