第05章-代谢物酶法分析技术

第五章代谢物酶法分析技术江苏大学基础医学与医学技术学院姜旭淦全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验

（第二版）代谢物酶法分析技术：用酶法分析的方法来测定体內的代谢物或代谢产物的技术。酶法分析（Enzymaticmethod）：以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶（辅基）、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。概念2目录

代谢物酶法分析的理论基础1代谢物酶法分析的方法

2代谢物酶法分析的设计要求

33第一节代谢物酶法分析的理论基础

代谢物酶法分析

平衡法（终点法）

速率法（动力学法）

4平衡法：标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法(end-pointmethod)。平衡法的特点是测定待测物的总变化量，即测定的是“浓度”。一、平衡法基本理论5积分得：

米氏方程

改写为

若反应达到平衡，假设，即[S0]－[St]≈[S0]，

则可简化为：达到平衡所需的时间与Km、Vmax、[S0]有关，Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、[S0]越小（待测物越少）则达到平衡所需的时间越短。6若[S0]<<Km

积分得：

可简化为：

若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标准管与测定管反应时间（t）一致，则有：7

标准管的[S0－St]与待测管的[S0－St]分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu。当[S0]－[St]≈[S0]，即反应基本达到平衡，Au和As基本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应，两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。8速率法(rateassay)又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度）。依据：当底物的消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。

速率法基本理论二、9根据米氏方程：

①当[S]<<Km，则[S]+Km≈Km②当酶量固定不变时，酶促反应的最大速度Vmax也不变符合一级酶促反应米氏方程改为：

10若同时带标准管，则有：标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，速度用△A/min来表示。上式改写为：速率法测定代谢物浓度的原理

在临床操作中，只要测定期间待测物消耗<5%，测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度。11酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序；试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染；酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。

代谢物酶法分析主要优点：代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法。代谢物酶法分析的方法

第二节12直接法：待测物与产物在理化性质上有便于检测的信号，可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析的方法。单酶反应直接法一、13（一）单底物反应直接测定法

尿酸+O2+H2O尿囊素+CO2+H2O2胆绿素+H2O胆红素+O2

尿酸在293nm

处有吸收，而尿囊素没有吸收，在293nm

处测定吸光度下降来对其定量。胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在450nm处测定吸光度下降。尿酸紫外法测定胆红素测定14胆红素氧化酶法

胆红素呈黄色，在450nm处有最大吸收峰，胆红素氧化酶催化胆红素氧化形成胆绿素，随着胆红素被氧化，胆红素在450nm处吸光度下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。在pH为8.0的条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测450nm吸光度的下降值反映的是总胆红素的含量。15（二）双底物反应直接测定法

对于双底物反应，在实验设计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大，即[S2]>>Km2，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。以NADH或NADPH为底物的终点法测定中，因340nm吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。

16第17页脱氢酶法测定乳酸根据乳酸在乳酸脱氢酶（LD）催化下脱氢生成丙酮酸，氧化型NAD+接受氢转变成还原型NADH。加入硫酸肼可捕获产物丙酮酸促成反应完成。生成的NADH与乳酸为等量摩尔，于340nm波长测定NADH的吸光度，可计算出血液中的乳酸含量。17第18页脱氢酶法测定丙酮酸是乳酸测定的逆反应，丙酮酸在LD的催化下，接受NADH递给的氢，还原为乳酸并生成NAD+。根据NADH吸光度的下降值可测定样品中的丙酮酸。18第19页脱氢酶法测定血浆β–羟丁酸β-羟丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的催化下，被氧化生成乙酰乙酸，同时NAD+被还原为NADH，在pH8.5时测定340nm波长下NADH吸光度上升的速率，就可以计算出血浆中β-羟丁酸的浓度。19酶偶联法：酶促反应的底物或产物没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法。最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。

酶偶联法二、20（一）脱氢酶指示系统

辅酶Ⅰ(NAD+)

或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型NAD(P)H后，在340nm

处的吸光度增高来计算出被测物的浓度。NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测定340nm

处吸光度的下降来计算被测物的浓度。21脱氢酶指示系统

血清葡萄糖己糖激酶法测定

Glu+ATPG-6-P+ADPG-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反应将NADP+转化为NADPH+H+，测定340nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比

22脱氢酶指示系统

血清尿素测定

尿素+H2O2NH3+CO2NH3+α-酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸+H2O+NAD+测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定。23但该法存在内源性氨和外源性氨，以及内源性脱氢酶和还原型辅酶的干扰，需采用含LD抑制剂（如高浓度丙酮酸）的双试剂法来测定，否则测定结果偏高。第24页酶偶联脱氢酶法测定尿素方法性能评价尿素酶偶联脱氢酶法测定血清尿素方法简便、快速，适用于临床常规分析24第25页脱氢酶法测定肌酐肌酐在肌酐亚氨基水解酶(CRDI)的作用下水解为N-甲基-乙内酰脲和NH4+，NH4+与NADPH和α-酮戊二酸在GLDH的作用下，生成L-谷氨酸和NADP+，记录340nm处吸光度的下降，进而计算出标本中肌酐的浓度。25第26页②该方法的主要缺点是试剂不够稳定，且肌酐酶来源困难，使得试剂盒价格昂贵，影响其在临床实验室的普遍使用。①肌酐脱氢酶法与参考方法高效液相色谱法具有良好的相关性，精密度好、准确度高、线性范围宽，不受黄疸、乳糜血、溶血和临床常用治疗药物及体内代谢物的干扰，结果更趋于真值，易于自动化分析，可用于血液及尿液的检测。肌酐脱氢酶法性能评价③相比之下，肌氨酸氧化酶法具有灵敏度高，线性范围宽，试剂稳定性好等优点。26第27页酶法测定血浆碳酸氢根血浆中的HCO3-在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化下，与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反应，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸和苹果酸脱氢酶（MDH）反应，生成苹果酸，同时将NADH氧化成NAD+；在340nm波长处吸光度的降低与样品中HCO3-含量成正比。27（二）过氧化物酶指示系统

共用的指示反应最早由Trinder等人提出，被称为Trinder反应。广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定28化学名英文缩写最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585过氧化物酶指示系统

常用的Trinder反应生色基团

29第30页1.葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖根据GOD可以高特异性的催化葡萄糖氧化成为葡萄糖酸并同时产生H2O2，生成的H2O2参与Trinder反应，生成醌亚胺色素，在505nm波长下比色检测，生成的吸光度与葡萄糖浓度成正比。30第31页2.酮胺氧化酶法测定糖化血清蛋白GSP在蛋白酶K的作用下可形成糖化蛋白片段，该片段在KAO的作用下分解为氨基酸、葡萄糖和H2O2，生成的H2O2即可用Trinder反应测定。31第32页3.甘油磷酸氧化酶法测定血清三酰甘油血清TG可被LPL水解为甘油和脂肪酸，生成的甘油被甘油激酶（GK）及ATP磷酸化后形成3-磷酸甘油，磷酸甘油氧化酶（GPO）氧化3-磷酸甘油产生H2O2，生成的H2O2参与Trinder反应而被测定。324.血清总胆固醇氧化酶测定法

胆固醇酯+H2O胆固醇+O2胆固醇+脂肪酸△4-胆甾烯酮+H2O2红色醌类化合物H2O2+4-AAP+

酚指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500nm处比色测定33第34页5.匀相法测定HDL-C利用一系列反应先将CM、VLDL、LDL或其反应产物清除，然后加入一种特殊的选择性表面活性剂，使HDL颗粒形成可溶状态，其释放的胆固醇和胆固醇酯与CEH及COD反应，生成的H2O2用Trinder反应测定。34利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增。

当待测物浓度很低时，指示反应可检测信号很小。利用酶促反应，使待测物和终产物之间的部分反应能循环进行，使检测信号不断增加。。。。。

酶循环法三、35使用两种酶，一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质（或其衍生物）或靶物质的氧化产物作为底物循环。（一）产物循环----氧化酶－脱氢酶系统

ABCEaEaEi36产物循环-------氧化酶－脱氢酶系统

甘油浓度测定

检测指示系统：①循环前、后用速率法测定NADH(340nm)的变化。②检测产物H2O2可通过Trinder

反应比色测定。37（二）底物循环ABCEa1Ea2EiABEiEa(i)DEa3ABCEa1Ei38（二）底物循环

1.脱氢酶－辅酶系统用一种脱氢酶和两种辅酶（thio-NAD+

和NADH）。用395nm～415nm波长测定反应中氧化型thio-NAD+

转为还原型thio-NADH的增加速度。39血淸胆汁酸测定

胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。

402.转移酶-水解酶系统

——同型半胱氨酸酶法测定腺苷S-腺苷同型半胱氨酸次黄苷413.合成酶－脱氢酶系统

-----------氨的测定NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经亮氨酸脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成NADH，在340nm测定。

42很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去或降低其催化活性。无活性或低活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶复活或激活，复活或激活的比例可反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。激活剂和抑制剂法四、根据有抑制剂存在时，酶促反应动力学发生改变来测定抑制剂的含量。43激活剂与酶结合后恢复酶的催化活性44抑制剂与酶结合后抑制酶的催化活性45第46页无机离子测定：（一）丙酮酸激酶法测定钾离子（二）β-半乳糖苷酶法测定钠离子（三）淀粉酶法测定氯离子（四）异柠檬酸脱氢酶法测定镁离子1酶激活和酶抑制测定法微量元素测定：（一）超氧化物歧化酶法测定铜离子（二）碳酸酐酶法测定锌离子有机磷测定461.异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子

异柠檬酸+NADP+α-酮成二酸+CO2+NADPH+H+用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA)抑制钙离子，标本中Mg2+通过恢复ICD活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使NADP+还原。

472.葡萄糖激酶法测定血清镁

483.Na+的酶法测定Na+

激活β-半乳糖苷酶水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），产生在420nm波长有特征吸收光谱的产物邻-硝基酚。邻-硝基酚产生的速率与Na+离子浓度呈正比。494.丙酮酸激酶法测定血清钾

反应中NADH的消耗量与血清中钾离子浓度呈正比。通过在340nm处监测吸光度下降速率，即可以计算钾离子含量。505.氯离子测定51第52页第52页第52页第52页第52页6.超氧化物歧化酶法测定铜离子黄嘌呤（xanthine）在黄嘌呤氧化酶（XO）的作用下可以生成O2-，该物质可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜，后者在560nm处有强吸收，而SOD可清除O2-，从而抑制了甲臜（NBTFormazan）的形成。反应液的颜色（蓝色）越深，说明SOD活性愈低，间接的反映血清中Cu2+离子的浓度，吸光度与浓度成反比。52第53页第53页第53页第53页第53页第53页7.碳酸酐酶法测定锌离子将标本加入试剂中，标本中的锌即与无活性的碳酸酐酶结合，形成有活性的碳酸酐酶，催化醋酸对硝基酚生成黄色的对硝基酚，在405nm附近有吸收峰。在一定反应时间内，生成的对硝基酚吸光度变化速率大小与锌浓度成正比。53第54页8.酶抑制剂法测定有机磷乙酰胆碱酯酶催化底物水解生成乙酸和胆碱，后者与5,5-二硫代-双-2-硝基苯甲酸反应，生成黄色产物5-硫代-2-硝基苯甲酸，它在410nm处有最大吸收，测定它在单位时间内的生成量，即可测得乙酰胆碱酶的活性。当待物中含有机磷时反应受到抑制，乙酰胆碱酯酶活性降低，吸光度与有机磷浓度成反比。54试剂酶质量要求试剂酶概念试剂酶特征试剂酶纯度酶法设计要求

酶法设计共性要求平衡法设计的要求速率法设计的要求代谢物酶法分析的设计要求

第三节试剂酶来源55试剂酶：作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。试剂酶的质量要求一、（一）试剂酶的概念56主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用。不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。

（二）试剂酶的来源和理化特征57不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD（P）H为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。

纯度主要指标：①酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。②杂酶含量。