转基因动物技术原理与应用

利用小鼠动物模型

研究基因表达与病理发育

郑耀武转基因动物实验中心综合实验楼20585098583现在是1页\一共有87页\编辑于星期二转基因动物技术原理与应用第一部分： 常规转基因技术原理第二部分： 基因定位修饰技术原理第三部分：

CRISPR/Cas9技术原理与应用现在是2页\一共有87页\编辑于星期二第一部分常规转基因动物原理与应用现在是3页\一共有87页\编辑于星期二什么是转基因？狭义：人为将DNA片段插入基因组广义：人为的对生物基因组的修饰，包括随机的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定点突变等现在是4页\一共有87页\编辑于星期二动物转基因的重要性基础理论研究

（小鼠）研究基因调节，包括启动子功能基因功能追踪（Knockout，GeneTrap）细胞追踪，如癌细胞转移（如EGFP基因敲入）基因表达与胚胎发育，器官发育基因表达与生物学功能、病理发育基因突变体表达功能研究基因相互作用应用研究（大动物）生产活性蛋白：酶，疫苗，抗体，生长因子，蛋白药（蛋白活性要求特异的翻译后修饰）低生产成本：转基因动物可以传代，可以连续生产，如血浆蛋白，乳蛋白，比细胞培养成本低病理动物模型，利用动物模型研究疾病发生机理、药效测试器官移植：解决器官不足，重复感染问题，如猪肝脏品种改良(GMO)：抗病，高产，营养价值提升疾病治疗：治疗遗传缺陷，组织再生现在是5页\一共有87页\编辑于星期二转基因技术研究历史第一个转基因小鼠：1974年第一个小鼠干细胞：1981年第一个基因捕获小鼠：1989年第一个基因敲除小鼠：1997年第一个克隆动物：2008年第一个CRISPR/CAS9小鼠RudolfJaenischin1974.JaenishsuccessfullymanagedtoinsertforeignDNAintoearly-stagemouseembryoresultingmicecarriedmodifiedgeneinalltheirtissuesandprogeny.Gossler,A.,A.L.Joyner,etal.(1989)."Mouseembryonicstemcellsandreporterconstructstodetectdevelopmentallyregulatedgenes."Science244(4903):463-5.

MartinGR.Isolationofapluripotentcelllinefromealrymouseembryosculturedinmediumconditionedbyteratocarcinomastemcells.ProcNatlAcadSci

(USA).1981;78:7634-8.HooperM,HardyK,HandysideA,HunterS,MonkM.HPRT-deficient(Lesch-Nyhan)mouseembryosderivedfromgermlinecolonizationbyculturedcells.Nature.1987;326:292-5.

MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.Science.2013Feb15;339(6121):819-23.doi:10.1126/science.1231143.Epub2013Jan3.Dolly(5July1996–14February2003)wasafemaledomesticsheep,andthefirstmammaltobeclonedfromanadultsomaticcell,usingtheprocessofnucleartransfer.现在是6页\一共有87页\编辑于星期二常见转基因技术常规方法：受精卵细胞核DNA显微注射，随机插入，预见性低，但多样性利用精子转染DNA，效率低，重复性差利用转坐子进行DNA在基因组的插入，方法复杂，受限多病毒感染：效率高，随机性低，可带DNA大小受限制，安全隐患，常用于大动物干细胞／胚胎显微注射：常用于小鼠基因定位修饰，预见性高，费时，大动物不成功核移植／动物克隆：大动物基因定位修饰唯一途径CRISPR/Cas9技术：最新发展的，快速、简便、高效基因组修饰技术现在是7页\一共有87页\编辑于星期二真核基因结构与调节真核基因结构（ciselement)：启动子(promoter)，外显子(exon)，内含子(intron)，polyA信号,活化信号（enhancers),沉默信号（silencers），封闭区(Insulators)转录因子(transelement)(transcriptionfactors)，活化因子(activators)，抑制因子(inhibitors)真核mRNA结构：Cap，5’非编码区(5’-UT)，编码区(codingregion)，3’非编码区(3’-UT)，polyA组织专一性调节(tissue-specificregulation,spatial)发育阶段调节(developmentalregulation,timingly)诱导性调节(inducible)转录后调节:mRNA剪接和修饰，mRNA的稳定性，蛋白质合成效率，蛋白质半衰期

现在是8页\一共有87页\编辑于星期二基因结构图示mRNA结构IV3’-UTAATAAAExonIGG5’-UTRAAAAAAAAA3’-UTRIIIIIIVIntronI翻译起始点ExonIICCAATboxTATAboxEnhancer转录起始点ExonI5’UT…现在是9页\一共有87页\编辑于星期二基因转录复合体现在是10页\一共有87页\编辑于星期二转基因载体构建启动子选取cDNA选取PolyA选用内含子和封闭区载体构建现在是11页\一共有87页\编辑于星期二启动子的类型和选取特异启动子：研究基因调节（lacZ），启动子功能，调节其它基因表达。用于其它基因表达，一定要查询启动子在转基因动物应用文献，了解启动子完整性高表达启动子选用：用于高表达某个基因，高表达蛋白生产广谱启动子应用：显示基因细胞标记（EGFP）可诱导启动子的应用：用于基因调节，有毒蛋白表达，致命基因的调控复合启动子：可诱导、高表达、组织专一基因调节系统，用于调节基因或高表达蛋白现在是12页\一共有87页\编辑于星期二表达基因（cDNA）的类别显示基因(reporters):lacZ,GFP,CAT,AP等调节基因:Cre,ER-Cre,tTA,tTR,PTX等蛋白质功能研究：蛋白突变体的表达基因剪接：研究外显子、内含子功能商业基因：药用蛋白，改良基因等生理功能基因:基因治疗，干细胞移植等非编码基因：非编码RNA功能研究，siRNA基因沉默,CRISPR/Cas9gRNA基因组修饰抗性基因：细胞筛选现在是13页\一共有87页\编辑于星期二其它转基因载体构件选取polyA

：提供稳定的mRNA常用polyA:SV40polyA,-GlobinpolyA内含子选用：第一个内含子，如-Globin内含子封闭区应用：增加表达几率，减少对周围或被周围基因影响Loxp,FRT,tetO序列现在是14页\一共有87页\编辑于星期二基因A启动子典型转基因结构（Heterologous）CCAATboxTATAboxEnhancer转录起始点基因BcDNA翻译起始点基因CpolyA5’-UT3’-UT拼接区域：现在是15页\一共有87页\编辑于星期二转基因动物（Founders）鉴定检测转基因在基因组插入：PCRSouthern拷贝数：Southern,RealtimePCR插入位点：InversePCRmRNA表达：InSituRT-PCRNorthern蛋白表达：显示基因：酶活性分析lacZ，Luciferase，AP,荧光EGFP,RFP功能分析：结构变化：石蜡切片，H&E染色免疫组织化学、免疫荧光定位：冰冻切片，抗体染色免疫沉淀：Western现在是16页\一共有87页\编辑于星期二小鼠生物学基础及转基因优越性小鼠免疫力强，繁殖率高，体型小，为经济有效动物模型小鼠遗传表型多样，全基因组序列解析，经典哺乳类实验动物模型多种自交系孕期19－21天性成熟时间：母4－5周，雄5-6周母鼠发情周期5天左右成鼠体重：20-50克母鼠平均产子5－6窝，自交系每窝6-8只，远交系10-14只现在是17页\一共有87页\编辑于星期二产生转基因鼠标准条件和要求

洁净动物房，高蛋白，高脂肪饲料（Breederchows)供卵鼠：4-6周杂交子一代母鼠(C57B6xCBAorDBA),每次10-12只，每周两次种鼠：年龄两月到一年的杂交子一代雄鼠(C57B6xCBAorDBA)20-24只代孕母鼠：每次见栓2-5只，2-6月高繁殖率母鼠(CD1)50-100只结扎公鼠：(C57B6xCBAorDBA)子一代或(CD1)雄鼠，各需求10-20只，适用年龄2-18月现在是18页\一共有87页\编辑于星期二转基因小鼠具体操作过程构建载体，纯化DNA片段，去除原核载体序列促排卵激素超排卵，合笼，分离E0.5受精卵DNA显微注射胚胎培养过夜胚胎回移代孕鼠切尾鉴定传代杂交表达分析现在是19页\一共有87页\编辑于星期二转基因鼠建立时间表注射出生分窝传代F1出生分窝分析孕期转基因鼠鉴定传代鉴定性成熟孕期时间（月）012345出生率30－50%转基因比率15－50%传代效率

~90%性成熟现在是20页\一共有87页\编辑于星期二供体受精卵收集，每次100－200个供体受精卵细胞核DNA显微注射浓度:2-5ng/ul受精卵回移代孕母鼠:每只移植20-30个左右双细胞卵

PCR或Southern筛选转基因鼠(founders),15-50%,随机插入，拷贝数1-≥100

第一代下传（F1)0-100%，有卵裂后插入或两个以上的插入位点

第二带下传，蒙德尔遗传，50％表达功能分析：从E10到5个月转基因鼠产生相关的数据现在是21页\一共有87页\编辑于星期二转基因常见问题启动子不完整，造成基因不表达或错误表达DNA插入随机性造成不表达、低表达、鼠系间差异封闭区(insulaters)序列基因高表达毒性，得不到转基因鼠或不表达第一个内含子重要性转基因片段的大小：2kb到>1000kb大部分2-10kb,容易注射P1质粒(PAC),70kb左右，黏度大细菌人工染色体BAC，120kb左右，黏度更大酵母人工染色体YAC，500kb-1000kb，非常难注射同时注射两个以上的转基因：效率高，一般插入同一位点多拷贝插入方式：头尾相接拷贝数与表达水平：无紧密关联，多数拷贝被甲基化，转录因子浓度限制其它因素：DNA浓度(2-3ng/ul)，酒精、嗅化乙锭和EDTA残留载体骨架DNA对转基因表达影响：原核序列不稳定C57/BL6纯系转基因鼠受精卵注射：效率略低现在是22页\一共有87页\编辑于星期二转基因动物原理及应用第一部分： 常规动物转基因技术原理第二部分：

基因定位修饰技术原理第三部分：

CRISPR/Cas9技术原理与应用现在是23页\一共有87页\编辑于星期二第二部分：基因定位修饰基因定位修饰原理基因定位修饰过程基因定位修饰应用

现在是24页\一共有87页\编辑于星期二基因定位修饰重要性基因功能研究：随着基因组解析，基因敲除和基因定位修饰进行基因功能解析基因调节：可以人为控制基因位点准确修饰，基因调节更为精确，研究结果更确定，病理模型更有价值基因修饰稳定性，低拷贝，对基因组影响小，表达特定蛋白，大动物克隆，抗体基因组置换基因治疗：准确定位修饰，结合人类干细胞培养和CRISPR/Cas9技术，是将来基因治疗(GeneTherapy)、组织再生(RegenerationMedicine)重要途径现在是25页\一共有87页\编辑于星期二小鼠早期发育示意图3.5天现在是26页\一共有87页\编辑于星期二干细胞特性祖细胞(projenitorcells)的特性可以分化成少数不同种类细胞的原性细胞，可以进行有限次数的不等分裂干细胞(stemcell)的特性可以分化成多种组织器官、不断增殖的少数细胞胚胎干细胞(ES)具有全能性每个细胞可以发育分化成任何组织器官、个体小鼠胚胎干细胞来源：囊胚内细胞群(ICM)来源种系：多数129SV/jae,少数C57/BL6毛色：棕色(129),黑色(C57/BL6)性别：雄性干细胞更稳定

现在是27页\一共有87页\编辑于星期二GeneTrap(基因捕获）源于小鼠干细胞全能性的发现标示基因高通量小鼠基因组随机插入，基因分析利用无启动子标示基因表达框，前端有内含子/外显子剪接信号，后面有PolyA，中间有抗性基因随机插入内含子后会剪接成融合表达蛋白，标示基因表达原基因位点失活公数据共平台库：InternationalGeneTrapConsortiumiscentralizingdataandcelllinescanberequestedfromthem.

现在是28页\一共有87页\编辑于星期二基因定位修饰载体类型简单基因敲除载体构建原理条件性敲除载体构建原理点突变显示基因敲入组织专一基因位点敲入（LacZ,EGFP），研究基因表达广谱loxp敲入，与调节基因Cre结合，进行组织特异性敲除现在是29页\一共有87页\编辑于星期二NEO13TKXX1NEO3132野生型载体重组后基因敲除载体设计原理

现在是30页\一共有87页\编辑于星期二NEOTKFRTFRTloxPloxP野生型载体用Flipase去NEOFRTCRE杂交失活基因loxPFRT条件性敲除载体构建原理现在是31页\一共有87页\编辑于星期二现在是32页\一共有87页\编辑于星期二Genetargetinginembryonicstemcellshasbecometheprincipaltechnologyformanipulationofthemousegenome,offeringunrivalledaccuracyinalleledesignandaccesstoconditionalmutagenesis.Tobringtheseadvantagestothewiderresearchcommunity,large-scalemouseknockoutprogrammesareproducingapermanentresourceoftargetedmutationsinallprotein-codinggenes.Herewereporttheestablishmentofahigh-throughputgene-targetingpipelineforthegenerationofreporter-tagged,conditionalalleles.Computationalalleledesign,96-wellmodularvectorconstructionandhigh-efficiencygene-targetingstrategieshavebeencombinedtomutategenesonanunprecedentedscale.Sofar,morethan12,000vectorsand9,000conditionaltargetedalleleshavebeenproducedinhighlygermline-competentC57BL/6Nembryonicstemcells.High-throughputgenomeengineeringhighlightedbythisstudyisbroadlyapplicabletoratandhumanstemcellsandprovidesafoundationforfuturegenome-wideeffortsaimedatdecipheringthefunctionofallgenesencodedbythemammaliangenome.现在是33页\一共有87页\编辑于星期二基因定位修饰过程干细胞分离、培养，多用固定细胞系基因定位修饰载体构建干细胞转染和重组克隆筛选干细胞囊胚显微注射嵌合体产生与传代杂合体产生纯合体产生基因功能的分析现在是34页\一共有87页\编辑于星期二利用小鼠干细胞进行基因打靶过程现在是35页\一共有87页\编辑于星期二嵌合体的传代杂交嵌合体（Founders）ES均来源于129鼠系，为棕色(agouti)C57／BL6

囊胚为黑色(black)ES注入后，毛色可以预测干细胞并入比例40-100%雄性嵌合体与C57/BL6母鼠交配6周左右与两只C57母鼠杂交，每周换一次母鼠棕色为显性，如果连续六窝全黑，放弃嵌合鼠现在是36页\一共有87页\编辑于星期二现在是37页\一共有87页\编辑于星期二现在是38页\一共有87页\编辑于星期二现在是39页\一共有87页\编辑于星期二现在是40页\一共有87页\编辑于星期二输卵管移植子宫移植代孕鼠电击筛选囊胚注射转基因和基因定位修饰过程的比较Founder的产生

传代，分析受精卵细胞显微核注射现在是41页\一共有87页\编辑于星期二转基因与基因打靶比较转基因基因打靶遗传特性显性，稳定或不稳定，多用于基因过表达隐性或显性，稳定多用于失活基因插入位点随机，不可控固定位点，可人为控制拷贝数多变,1to>100杂合1,纯合2表达取决于插入位点和启动子完整性模仿原基因表达模式时间五个月以上九个月以上花费3万元以上8-10万美元周围基因相互影响一般有影响无法预测一般没有影响可以预测现在是42页\一共有87页\编辑于星期二第三部分基因定位修饰进展CRISPR/Cas9技术原理利用CRISPR/Cas9技术研究生理、病理发育现在是43页\一共有87页\编辑于星期二DNA随机突变（化学诱变，放射线诱变）转基因技术（DNA片段基因组随机插入）小鼠全能干细胞发现和应用（基因捕获）基因打靶（DNA重组基因定位修饰）锌指核酸酶ZNF（基因组定位切割修饰）TALEN（基因组定位切割修饰）CRIPSR-Cas9（基因组定位切割修饰）基因组修饰历史现在是44页\一共有87页\编辑于星期二利用ZFN技术进行基因组修饰2000早期，研究者开发了锌指核酸酶（ZFN）技术,首次利用人工构建DNA序列特异核酸酶，对基因组进行识别、切割和修饰锌指酶发源于转录因子结构，类似于转录因子，具有两个结构域：人工设计DNA-bindingzinc-fingerprotein(ZFP)domainFokIDNAnucleasedomainDNA识别域由3-6个Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白区结合3’-5’方向DNA链上特异三联体碱基以及5’-3’方向的一个碱基ZFN以二聚体结合到靶位点上，相距5-7个碱基，通过两个FokI核酸酶切割靶位点由于信息有限，设计复杂，有多达60种的锌指库，设计完美的锌指核酸酶要花费很长时间现在是45页\一共有87页\编辑于星期二ZFN工作原理现在是46页\一共有87页\编辑于星期二利用TALEN技术进行基因组修饰Transcriptionactivator-likeeffectornucleases(TALENs)TALENs同样包括两个结构域，一个是DNABinding，另一个是FokInucleaseTranscriptionactivator-likeeffectors(TALEs)为33–35aminoacidrepeats,每一个repeat识别一个碱基对，由中间的第12和13氨基酸决定，称为repeatvariablediresidues(RVDs).最常用的四组为Asn-Asn,Asn-Ile,His-AspandAsn-Gly，分别识别G,A,C和T四个碱基。现在是47页\一共有87页\编辑于星期二TALEN工作原理现在是48页\一共有87页\编辑于星期二CRISPR/Cas9发现与应用进展现在是49页\一共有87页\编辑于星期二现在是50页\一共有87页\编辑于星期二最初发现于bacteriaorarchaea，由protospacers和directrepeat序列顺序排列，可以转录成crRNA和tracrRNA两种小RNA。Protospacers，DNAfragments(~20bp)，来源于噬菌体或质粒，相间于directrepeat，统称为CRISPR。两个小RNA与CRISPR-associatedprotein9(Cas9)一起，具有DNA特异序列endonuclease活性，识别和切割外源DNA、RNA，行使免疫保护功能。crRNAandtracrRNA可以通过DNA转录成single-chainguideRNA(sgRNA)，同样具有CRISPR功能。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat(CRISPR)现在是51页\一共有87页\编辑于星期二CRISPR－Cas9工作原理现在是52页\一共有87页\编辑于星期二常用表达系统

AvailableExpressionCassette现在是53页\一共有87页\编辑于星期二现在是54页\一共有87页\编辑于星期二常用质粒px330现在是55页\一共有87页\编辑于星期二现在是56页\一共有87页\编辑于星期二PAM序列出现频率现在是57页\一共有87页\编辑于星期二设计简单效率高特异性强一次性多位点修饰适用于各种生物用途广CRISPR－Cas9系统优势现在是58页\一共有87页\编辑于星期二CRISPR－Cas9技术应用现在是59页\一共有87页\编辑于星期二Cas9蛋白和导向RNA共转染人细胞基因组修饰1）核定位Cas9蛋白2）U6启动子带动的一个或多个导向RNA3）导向RNA紧跟着正确的PAM序列4）任何GN20NGG均可为靶点现在是60页\一共有87页\编辑于星期二现在是61页\一共有87页\编辑于星期二现在是62页\一共有87页\编辑于星期二3gene,6locustargetingefficiency现在是63页\一共有87页\编辑于星期二现在是64页\一共有87页\编辑于星期二现在是65页\一共有87页\编辑于星期二现在是66页\一共有87页\编辑于星期二现在是67页\一共有87页\编辑于星期二现在是68页\一共有87页\编辑于星期二现在是69页\一共有87页\编辑于星期二现在是70页\一共有87页\编辑于星期二现在是71页\一共有87页\编辑于星期二现在是72页\一共有87页\编辑于星期二Nickase工作原理现在是73页\一共有87页\编辑于星期二Cas9突变，细菌筛选不同PAM序列增加了特异性发现更多的Cas9变异型具有更好的特异性发现更小的Cas9变异型说明还有挖掘潜力和改进的空间现在是74页\一共有87页\编辑于星期二Cell.2015Oct22;163(3):759-71.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.Epub2015Sep25.Cpf1IsaSingleRNA-GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR-CasSystem.ZetscheB1,GootenbergJS2,AbudayyehOO3,SlaymakerIM3,MakarovaKS4,EssletzbichlerP3,VolzSE3,JoungJ3,vanderOostJ5,RegevA6,KooninEV4,ZhangF7.AbstractThemicrobialadaptiveimmunesystemCRISPRmediatesdefenseagainstforeigngeneticelementsthroughtwoclassesofRNA-guidednucleaseeffectors.Class1effectorsutilizemulti-proteincomplexes,whereasclass2effectorsrelyonsingle-componenteffectorproteinssuchasthewell-characterizedCas9.Here,wereportcharacterizationofCpf1,aputativeclass2CRISPReffector.WedemonstratethatCpf1mediatesrobustDNAinterferencewithfeaturesdistinctfromCas9.Cpf1isasingleRNA-guidedendonucleaselackingtracrRNA,anditutilizesaT-richprotospacer-adjacentmotif.Moreover,Cpf1cleavesDNAviaastaggeredDNAdouble-strandedbreak.Outof16Cpf1-familyproteins,weidentifiedtwocandidateenzymesfromAcidaminococcusandLachnospiraceae,withefficientgenome-editingactivityinhumancells.IdentifyingthismechanismofinterferencebroadensourunderstandingofCRISPR-Cassystemsandadvancestheirgenomeeditingapplications.现在是75页\一共有87页\编辑于星期二FengZhanglab'sTargetFinder
IdentifiesgRNAtargetsequencesfromaninputsequenceandchecksforoff-targetbinding.Currentlysupports:Drosophila,Arabidopsis,zebrafish,C.elegans,mouse,human,rat,rabbit,pig,possum,chicken,dog,mosquito,andstickleback.MichaelBoutroslab'sTargetFinder(E-CRISP)
IdentifiesgRNAtargetsequencesfromaninputsequenceandchecksforoff-targetbinding.Currentlysupports:Drosophila,Arabidopsis,zebrafish,C.elegans,mouse,human,rat,yeast,frog,Brachypodiumdistachyon,Oryzasativa,OryziaslatipesRGENTools:Cas-OFFinder
IdentifiesgRNAtarget