氨基酸的发酵

氨基酸的发酵第1页，共56页，2023年，2月20日，星期五第11章氨基酸发酵11.1概述一、氨基酸的种类氨基酸是组成蛋白质的基本单位，通常由5种元素组成，即C、H、O、N、S。在自然界中，已发现组成蛋白质的氨基酸有20多种，而这20多种氨基酸都是羧酸分子中α-C上的一个氢被氨基所取代而成的化合物，故称α-氨基酸。第2页，共56页，2023年，2月20日，星期五二、氨基酸的应用1、在医药工业中的应用2、在食品工业中的应用3、在饲料工业中的应用4、在农业中的应用5、在化学工业中的应用第3页，共56页，2023年，2月20日，星期五三、氨基酸的生产方法1、蛋白质水解提取法将蛋白质经酸碱水解后，再经分离纯化获得各种氨基酸。2、直接发酵法

所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,积累特定的氨基酸。

20种基本氨基酸中有18种能用这种方法生产，其中产量最大的是谷氨酸。第4页，共56页，2023年，2月20日，星期五3、酶法利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。4、化学合成法利用有机合成和化学工程的技术生产和制备氨基酸5、添加前体发酵法又称微生物转化法。第5页，共56页，2023年，2月20日，星期五

传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的。所以现在生产氨基酸的方法多为微生物发酵法。四、氨基酸工业的发展现状和动态我国氨基酸工业是从20世纪60年代开始起步的，先后开展了蛋白质水解提取法、化学合成法、发酵法和酶法生产氨基酸的研究。

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目前生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司，但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。第7页，共56页，2023年，2月20日，星期五

在80年代中后期，我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品，1991年销售量为二千万瓶，1996年达六千万瓶，主要厂家有无锡华瑞、北京费森尤斯、昆明康普莱特，但生产原料都依赖进口。到2000年，世界氨基酸产值达45亿美元，占生物技术市场的7%，国内的氨基酸产值可达40亿元，占全国发酵产业总产值的12%。第8页，共56页，2023年，2月20日，星期五11.2谷氨酸的发酵生产

现在发酵法或酶法生产氨基酸已有20多种，已经成为氨基酸生产的主要方法。在各种氨基酸的生产中，以谷氨酸的发酵规模、产量最大。第9页，共56页，2023年，2月20日，星期五11.2.1谷氨酸生产原料

一、谷氨酸生产原料谷氨酸生产原料有碳源、氮源、无机盐和生长因子等。

1.碳源工业上谷氨酸发酵采用的碳源一般都是淀粉原料，如玉米、小麦、甘薯、大米等，其中甘薯和淀粉最为常用。第10页，共56页，2023年，2月20日，星期五

淀粉原料要先通过制糖工艺水解成微生物可直接利用的葡萄糖，然后再投放到发酵罐。此外也可用糖蜜原料作为碳源，如甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。糖蜜因富含生物素，在发酵前需要经活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。第11页，共56页，2023年，2月20日，星期五

2.氮源氮源是合成菌体蛋白质、核酸及谷氨酸的原料。氮源比碳源对谷氨酸发酵影响更大，约85％的氮源被用于合成谷氨酸，另外15％用于合成菌体。一般发酵工业碳氮比为100:（0.2～2.0），谷氨酸发酵的碳氮比为100:（15～21）。目前生产上多采用尿素或氨水作为氮源，进行分批流加。第12页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.无机盐无机盐是微生物维持生命活动不可缺少的物质。其中磷酸盐在谷氨酸发酵非常重要，它是谷氨酸发酵过程中必须的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。

4.生长因子糖质为碳源的谷氨酸生产菌几乎都是生物素缺陷型，以生物素为生长因子。在发酵过程中“亚适量”生物素有利于积累谷氨酸。实际生产中通过添加玉米浆、麸皮水解液、糖蜜等作为生长因子的来源，来满足谷氨酸生产菌必须的生长因子。第13页，共56页，2023年，2月20日，星期五二、淀粉水解糖的制备淀粉是由葡萄糖组成的生物大分子，大多数的微生物都不能直接利用，生产中都要求将淀粉进行糖化，制备成淀粉水解糖使用。在淀粉水解糖液中，主要糖分是葡萄糖，另外尚有数量不等的麦芽糖以其他一些二糖、低聚糖等糖类少量。淀粉水解糖的制备方法有下列4种：第14页，共56页，2023年，2月20日，星期五1、酸解法（酸糖化法）

它是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。淀粉酸（催化剂）高温高压葡萄糖第15页，共56页，2023年，2月20日，星期五优点：（1）生产简易，对设备要求简单。（2）水解时间短。（3）设备生产能力比较大。缺点：（1）要求有耐腐蚀、耐高温高压的设备。（2）副反应的发生，造成葡萄糖的损失而使淀粉的转化率降低。（3）淀粉颗粒大小不均造成水解不彻底。（4）淀粉乳浓度也不宜过高。第16页，共56页，2023年，2月20日，星期五2、酶解法（双酶水解法）

是用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖。此法分为两步：淀粉液糊精及低聚糖a-淀粉酶水解糖化酶水解液化（增加淀粉的可溶性）糖化葡萄糖第17页，共56页，2023年，2月20日，星期五优点：（1）酶水解反应条件较温和，不需要耐腐蚀、耐高温、高压的设备。（2）酶专一性强，水解副反应少，水解糖液纯度高，淀粉的转化率高。（3）可在较高的淀粉乳液浓度下水解。（4）糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于精制。第18页，共56页，2023年，2月20日，星期五缺点：（1）酶水解反应时间较长，一般从投料到糖化完毕需2～3天时间。（2）要求设备较多。（3）需要具备有专门培养酶的条件。（4）糖液过滤困难。第19页，共56页，2023年，2月20日，星期五3、酸酶结合法

酸酶结合水解法是集酸法和酶法制糖的优点而采用的结合生产工艺。根据淀粉原料性质又可分为酸酶水解法和酶酸水解法。第20页，共56页，2023年，2月20日，星期五（1）酸酶水解法淀粉糊精或低聚糖

酸糖化酶葡萄糖优点：（1）酸液化速度快，且用量少。（2）对液化液的要求不高。（3）可采用较高的淀粉乳浓度，以提高生产效率。第21页，共56页，2023年，2月20日，星期五（2）酶酸水解法淀粉乳淀粉液α-淀粉酶过滤、除杂

酸水解葡萄糖优点：（1）能采用粗原料淀粉。（2）淀粉浓度较酸法高，生产较易控制。（3）水解时间短，糖液色泽浅。（4）酸水解pH值稍高，可减少淀粉水解副反应的发生。第22页，共56页，2023年，2月20日，星期五

采用不同的水解制糖工艺，各有其优点和不足。从水解糖液的质量及降低糖耗，提高原料利用率方面考虑，双酶法最好，其次是酸酶法，最差的是酶酸法、酸法。从淀粉水解整个过程所需的时间来说，则酸法时间最短，双酶法时间最长。第23页，共56页，2023年，2月20日，星期五三、糖蜜原料的处理1、糖蜜的来源与特点

甘蔗糖厂的副产物甜菜糖厂的副产物2、糖蜜原料的处理（1）降低生物素含量：活性碳或树脂吸附、亚硝酸破坏等（2）添加青霉素（3）添加表面活性剂等第24页，共56页，2023年，2月20日，星期五

11.2.2谷氨酸生产菌及扩大培养一、生产菌经过鉴定和命名的谷氨酸生产菌很多，其中主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。它们都有以下共同特点：①菌体为球形、短杆至棒状，②无鞭毛、不运动，③不形成芽孢，④呈革兰氏阳性，⑤需要生物素做生长因子，⑥在通气条件下培养能产生谷氨酸。第25页，共56页，2023年，2月20日，星期五二、菌种的扩大培养斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32℃培养18-24h。

国内谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子培养的流程，即：斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐第26页，共56页，2023年，2月20日，星期五一级种子的常用培养基配方第27页，共56页，2023年，2月20日，星期五第28页，共56页，2023年，2月20日，星期五种子的质量要求:镜检菌体健壮，排列整齐，大小均匀二级种子的活菌浓度要求达到108～109个/ml要求二级种子活力旺盛平板检验，菌落淡黄色，呈半透明状小摇瓶发酵试验，产酸稳定并在高峰第29页，共56页，2023年，2月20日，星期五11.3发酵机制及工艺控制一、由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径第30页，共56页，2023年，2月20日，星期五二、葡萄糖合成谷氨酸的代谢途径第31页，共56页，2023年，2月20日，星期五三、生物合成途径葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和己糖磷酸支路（HMP途径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A（乙酰CoA），然后进入三羧酸循环，再通过乙醛酸循环、CO2固定作用，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4＋存在的条件下，生成谷氨酸。第32页，共56页，2023年，2月20日，星期五四、谷氨酸生物合成的调节机制1、糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节：（1）对EMP和HMP途径比例的影响（2）对糖代谢速度的影响（3）对乙醛酸循环的影响2、氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不转化成其他的氨基酸和参与蛋白质的合成。第33页，共56页，2023年，2月20日，星期五

生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶，又由于α-酮戊二酸脱氢酶的缺失，TCA循环被阻断，使ATP大量减少，导致蛋白质的合成停滞，在NH4＋适量时，合成谷氨酸并积累。3、细胞膜透性的调节（1）控制磷脂的合成导致形成磷脂合成不足的不完全细胞膜。方法有4种：①选育生物素缺陷型菌株，限制培养基中生物素的浓度；第34页，共56页，2023年，2月20日，星期五②选育油酸缺陷型菌株，限制培养基中油酸的浓度；③选育甘油缺陷型菌株，限制培养基中甘油的浓度；④添加表面活性剂（如吐温60）或高级饱和脂肪酸（C16-18）。

（2）控制细胞壁的合成导致形成不完全的细胞壁进而导致形成不完全的细胞膜。方法是在培养基中添加青霉素。第35页，共56页，2023年，2月20日，星期五4、环境因素引起的谷氨酸发酵的代谢转换第36页，共56页，2023年，2月20日，星期五五、谷氨酸发酵的工艺控制

1.菌龄及接种量的控制一般情况下，一级种子菌龄控制在11～12h，二级种子菌龄控制在7～8h

接种量0.6％～1.7％。发酵培养基成份不同，谷氨酸菌种种类性质、种龄不同，所用接种量也不同，应根据实际情况和实验情况具体确定。一般以1%为好。第37页，共56页，2023年，2月20日，星期五2.温度的控制

前期32±0.6℃，后期可提高到34～37℃。谷氨酸发酵前期，主要是长菌阶段，如果温度过高，菌种易衰老，严重影响菌体生长繁殖。因此，温度控制在谷氨酸最适生长温度32℃左右。在发酵后期，菌体生长基本结束，为了满足大量生成谷氨酸，可适当提高温度，控制在34～37℃。第38页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.pH的控制发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.5～8.0左右较为合适，而在发酵中、后期将pH值控制在7.0～7.6左右对提高谷氨酸产量有利。通常采用氨水流加法和尿素流加法调节pH，这样同时也是添加氮源。第39页，共56页，2023年，2月20日，星期五4.通风量与搅拌速度的控制在长菌阶段，若供氧过量，在生物素限量的情况下，抑制菌体生长，表现为耗糖慢，长菌慢，所以发酵前期以低通风量为宜。在发酵阶段，若供氧不足，发酵的主产物由谷氨酸变为乳酸，所以发酵中、后期以高通风量为宜。实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每分钟单位体积的通气量表示通风强度。另外发酵罐大小不同，所需搅拌转速与通风量也不同。第40页，共56页，2023年，2月20日，星期五11.4谷氨酸的提取工艺一、谷氨酸发酵液的性质在发酵液中，除含谷氨酸外，还存在菌体、残糖、色素、胶体物质及其他发酵副产物。发酵结束后，发酵液的温度在34~36℃，pH为6.0~7.5，接近中性；发酵液外观呈浅黄色浆状，表面浮有少许泡沫。第41页，共56页，2023年，2月20日，星期五二、谷氨酸的提取方法

谷氨酸的分离提纯主要根据它的两性电解质性质、溶解度、分子大小、吸附剂的作用及谷氨酸的成盐作用等，把它从发酵液中提取出来。目前提取谷氨酸的常用方法有等电点法、离子交换法、锌盐法等。随着科技的进步，电渗析、反渗透、纳滤膜等这些新技术也应用到了谷氨酸的提取中。第42页，共56页，2023年，2月20日，星期五1.等电点法等电点法是谷氨酸提取方法中最简单的一种，它具有操作简便、设备简单等优点，是目前谷氨酸生产多采用的方法。第43页，共56页，2023年，2月20日，星期五（1）原理

谷氨酸分子中含有两个酸性羧基和一个碱性氨基，在酸性条件下，即pH＜3.22时，α-羧基的电离受抑制，谷氨酸主要以阳离子形式存在，带正电荷；当pH＞3.22时，谷氨酸主要以阴离子形式存在，带负电荷；当pH＝3.22时（即等电点pI），谷氨酸净电荷为零，呈电中性，而此时其溶解度最小，会从溶液中析出，通过过滤、离心等可提取出谷氨酸。第44页，共56页，2023年，2月20日，星期五（2）谷氨酸的晶型及性质谷氨酸晶体有两种，分别是α-型和β-型。前者为斜方六面体，晶轴长短接近，晶体粗壮，颗粒大，纯度高，易沉淀分离，是理想晶体。后者晶轴长短不一，针状或鳞片状，晶粒微细，不易沉淀析出，所以在操作中，需控制条件以利于形成α-型。第45页，共56页，2023年，2月20日，星期五（3）谷氨酸提取的工艺流程第46页，共56页，2023年，2月20日，星期五（4）提取工艺控制①谷氨酸含量：用等电点法提取谷氨酸时，要求谷氨酸含量在4％以上，否则可以先浓缩或加晶种后，再提取。②结晶温度及降温速度：谷氨酸的溶解度随温度降低而降低，为了利于形成α-型晶体，温度要低于30℃，且降温速度要慢。

第47页，共56页，2023年，2月20日，星期五③加酸：加酸主要为了调节溶液pH至等电点，在操作时前期加酸稍快，中期（晶核）形成前要缓，后期加酸要慢，直至降至pI。④投晶种与育晶：加入一定量晶种，有利于提高谷氨酸收率。通常谷氨酸含量在5％、pH4.0～4.5时，加入晶种；谷氨酸含量在3.5％～4.0％、pH3.5～4.0时投放晶种，投放量约为发酵液的0.2～0.3％。第48页，共56页，2023年，2月20日，星期五⑤搅拌：在结晶过程中，搅拌有利于晶体的长大，但也不易过强，否则还会使晶体破碎，一般以20～30r/min为宜。⑥离心分离：谷氨酸发酵液经等电搅拌后，静置4～6h，谷氨酸晶体大多沉淀在设备底部，上清液（母液）再回收利用，而底部的固形物通过离心的方法得到谷氨酸粗品。第49页，共56页，2023年，2月20日，星期五2.其它方法（1）离子交换法：离子交换用强酸型阳离子交换树脂（732﹟）氢型吸附谷氨酸形成的阳离子后，再用60℃，4％的NaOH洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。（2）锌盐法：利用谷氨酸锌在水溶液中的溶解度低的原理，将发酵液中的谷氨酸一次进行回收。第50页，共56页，2023年，2月20日，星期五11.5味精的生产

从发酵液中提取到的谷氨酸，仅仅是味精生产的半成品。谷氨酸与适量碱作用，生成谷氨酸一钠，其溶液经过脱色、除铁、除杂，最后通过减压浓缩、结晶及分离，得到较纯的谷氨酸一钠晶体，不仅酸味消失，而且有很强的鲜味，这就是味精。如果谷氨酸与过量的碱作用，生成二钠盐，就不具有味精的鲜味。第51页，共56页，