电镜超薄切片2课件

电子显微术

图1日立H-7500，H-7600

图JEM-2100F日本电子图4Sirion场发射扫描电子显微镜

一、

电子显微镜的发展史1、光学显微镜的极限光学显微镜的分辨本领大约是可见波长的一半，可见波长为400--800nm，所以光学显微镜的分辨本领大约是0.2um。2、

1924年，法国科学家德.布罗意证明了任何一种快速运动的粒子，都具有波动性。1926年德国科学家布许发现，高速运动的电子在电场或磁场下，会发生折射，并且能被聚焦。高速运动的电子具有波动性和折射性是电子显微镜的基础。20世纪30年代，经过鲁斯卡、克诺尔、马顿等科学家的不懈努力，终于在1938年试制成功第一台实用电子显微镜。二、电镜的应用：正常结构；病理诊断；病原；化学；考古。

第一节、透射电子显微术一、

透射电镜的原理1高速运动的并具有波动性和折射性的电子2电镜的各种像差1）球差：是由于透镜不能把所有的入射光线聚集共同的焦点而产生的。2）像散：这一缺陷主要是由于电子透镜实际上不可能做得完全对称。3）

色差：可见光的波长不同。4）畸变:在低倍镜时经常发生.因为图像中心部分和周边部分的放大倍数不同.二、透射电子显微镜的结构

1电子枪2

聚光镜系统3

样品室4

成象系统:物镜、第一中间镜、第二中间镜、投影镜。5

观察和记录系统2聚光镜光阑和物镜光阑的选择聚光镜光阑：200-300um;物镜光阑：20-70um.3放大倍数的选择选择放大倍数的两个原则：①感兴趣的区域充满整个照相底片；②感兴趣的细节特征十分容易测到。4．选视野、调焦和拍照（1）把要拍照的视野移至屏中心6×9黑框内。（2）用OBFOCUS调焦，拍照前使OB置于稍欠焦位置上以增加反差。（3）核对是否存有像散，核对光斑是否居中，核对灯丝是否饱和对称。（4）根据事先已在计算机上设定好的最佳光强度，调节BRIGHTNESS，使PAG1上的

EXPTIME为设定值（参考第三章）。（5）盖上观察窗，按下PHOTO，即自动曝光。透射电子显微镜生物制品制备技术

Thephotooflightmicroscope冷冻蚀刻法超薄切片电镜细胞化学术

electronmicroscopecytochemistry免疫组织化学技术免疫电镜术

ImmunohistochemistryImmunoelectronmicroscopy

电镜放射自显影术显微放射自显影技术

Electronmicroscope

AutoradiographyMicroautoradiography现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术

、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。

1、

超薄切片样品的制备（1）

取材(基本要求是在活体情况下进行)取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则）1）

快速：1分钟之内投入固定液。2）

块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。3）

部位准4）

损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。5）

低温：0-4oC取材的方法1）动物材料：对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。2）培养细胞(Cellculture)：生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定处理后再离心成团，在50oC中弃去上清液，加入适量的经50oC预温的2%的琼浆，使团悬浮，将悬浮团和琼脂液一同在薄片上展层，固定后切成1mm3的小块。

理想的固定剂，应具备以下条件：①能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；②能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；③对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；④可保存酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。2）影响固定效果的因素①固定液的pH值②渗透压③缓冲液的类型④固定的温度和时间当前采用的是在0～4℃下固定1～4小时。3）常用的几种固定剂A四氧化锇（osmiumtetroxide,OsO4）亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.5-1g包装，淡黄色晶体。具有挥发性和毒性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有刺激作用，在通风橱内配制。

优点①对蛋白质、磷酸脂蛋白、核蛋白固定较好；②对脂类固定较好。③分子密度高，产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。缺点①不能固定糖元和核酸，对微管固定较差。②扩散慢，穿透能力差。③具有挥发性和粘膜毒性。④不适于进行细胞化学工作。B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2）特点：纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质，影响固定。优点(1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间，适用于进行超微细胞化学研究。

C甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对酶的活性保存好。

4）固定的方法A单固定法：单细胞或固定液易于浸透的组织1-2%四氧化锇（1-2h）。B双固定法：戊二醛（2.5%4oC2h）---锇酸（1%4oC2h）。C原位固定和灌注固定：附几种常见固定剂的配制固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,对含水较多的组织可用PH值8.0，细菌、病毒可用PH值在7.0以下。0.

2mol/L磷酸缓冲液的配制磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O）2.6g

磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）29g重蒸水加到500ml

调PH到7.40.2mol/L二甲坤酸盐酸缓冲液重蒸水25ml二甲坤酸钠（Na(CH3)2AsO2.3H2O）2.14g0.

1mol/L盐酸8ml重蒸水加至50ml调PH到7.4

B固定液的配制锇酸固定液的配制2%的锇酸固定液的配制：清洗烘干器皿1G锇酸+50ml双蒸水（棕色瓶）数日可用。0.1mol/L磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的1%锇酸固定液。2%的锇酸缓冲液10ml0.2mol/L缓冲液10ml调节PH应为7.3-7.4戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml）0.411.6重蒸水（ml）4.643.40.2ml/L缓冲液（ml）555戊二醛最终浓度12.54调节固定液PH值到7.3-7.4思考题1、要显示脑组织的胆碱脂酶，你选择什么固定液和固定方法？用什么技术方法？2、要显示心肌纤维的超微结构，你选择什么方法？为什么？（3）

脱水(dehydration)1）

清洗:固定后均用和固定液相同的缓冲液冲洗3次，每次15分钟2）

脱水：常用的脱水剂为乙醇和丙酮。Howtochoose?Why?乙醇引起组织中脂类物质抽提较丙酮少，且不会使组织变硬、变脆，故为常用脱水剂，然乙醇不容易和用于包埋剂的环氧树脂相混溶，因此在进入包埋剂之前常用中间剂环氧丙烷置换。脱水程序如下表浓度50%70%90%100%时间10′-15′10′-15′10′-15′3次（每次10′-15′）温度4oC4oC转室温室温经验(experiment)：①脱水剂临时配制。②浓度梯度上升。③脱水时间和浓度。④脱水时的连续性。⑤脱水剂的选择。（4）浸透是通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂取代脱水剂，使其渗透到组织中去。

脱水和包埋剂的比例2:11:2纯包埋剂时间1-2h2-3h2h温度室温室温37oC温箱经验(experiment)：①浸透时间。②浸透温度。（5）

包埋(embeding)：1)目的:包埋的目的是让包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片的各种力的作用，有利于切薄片。2)包埋剂的性质:①粘度适中，有良好的切割性能。②能耐受电子束的轰击，高温不易升华、不变形。③透明度好。④对人无害。3)包埋剂的种类①环氧树脂类：目前国内使用较多的环氧树脂有进口的Epon812和国产的618。原理:环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。②低粘度包埋剂(Spurr)

为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度的树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。③水溶性包埋剂：

是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。

原理:水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。包埋剂:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(简称GMA)、聚乙二醇、Aquon等④所加的固化剂，有十二烯基虎铂酸酐（DDSA）和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐（MNA）,增韧剂为邻苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速剂为2,4,6,一三苯酚（DMP—30）。环氧树脂的性能和配制：618树脂5ml十二烯基丁二酸酐DSA（固化剂）5ml苯二甲酸二丁酯DBP（增塑剂）0.3ml2,4.6三苯酚称DMP30（加速剂）0.1ml60oC烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌10分钟，至37oC温箱