选微生物的实验室培养详解演示文稿

选微生物的实验室培养详解演示文稿现在是1页\一共有49页\编辑于星期二优选选微生物的实验室培养现在是2页\一共有49页\编辑于星期二到目前为止，几十项诺贝尔生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关现在是3页\一共有49页\编辑于星期二微生物的类群原生生物(如草履虫、衣藻等)原核生物(细菌、蓝藻等)真菌(如酵母菌、霉菌等)病毒微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物。无细胞结构真核细胞原核细胞微生物:结构简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.现在是4页\一共有49页\编辑于星期二1、提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件2、确保其它微生物无法混入实验室培养微生物条件——培养基——无菌技术现在是5页\一共有49页\编辑于星期二1.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、尿素等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源一、培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。培养基的营养构成:碳源、氮源、水、无机盐＋特殊营养物质牛肉膏又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。

蛋白胨是肉类等蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。它可以作为微生物培养基的主要原料，一般来说，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、肉类）、植物蛋白（豆类）、微生物蛋白（酵母）等三种。能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。

现在是6页\一共有49页\编辑于星期二⑶无机盐Ca、K、Mg为大量元素，以无机盐阳离子形式被吸收，配培养基要加磷酸盐、硫酸盐。Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培养中有0.1PPM就可以了，自来水原料中已够用，不需另加。⑷水是细胞中生化反应的良好介质；营养物质和代谢产物都必须溶解在水里，才能被吸收或排出体（细胞）外。水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温度骤然上升。维持细胞的膨压（控制细胞形态）。现在是7页\一共有49页\编辑于星期二2.特殊营养物质：维生素、氨基酸、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH、氧气、渗透压等的需求：例如:生长因子(即微生物生长繁殖所必需的，而自身不能合成（或合成能力有限）的化合物。如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)现在是8页\一共有49页\编辑于星期二①按化学成分不同分：天然培养基/合成培养基4.培养基的种类种类化学成分是否明确用途天然培养基（如马铃薯、玉米粉等）否主要用于工业生产合成培养基（化学药品）是分类、鉴定现在是9页\一共有49页\编辑于星期二4.培养基的种类固体培养基液体培养基有无凝固剂琼脂②按物理状态不同划分:种类是否含凝固剂用途固体培养基半固体培养基液体培养基是（1.5%-2.5%）是（0.2%-0.7%否分离、计数、鉴定等观察微生物的运动、保存菌种等扩大培养、工业生产琼脂：一种从红藻中提取的多糖。在980C以上熔化，在440C以下凝固，在常规培养条件下呈固态。现在是10页\一共有49页\编辑于星期二固体培养基：观察菌落、鉴定、分离和计数划线法、稀释涂布分离法现在是11页\一共有49页\编辑于星期二半固体培养基：无动力有动力(弥散)观察微生物运动、保存菌种现在是12页\一共有49页\编辑于星期二液体培养基表面生长均匀混浊生长沉淀生长现在是13页\一共有49页\编辑于星期二鉴别培养基:在培养基中加入某种指示剂或化学药品。用以菌种的鉴别。4.培养基的种类③按用途不同划分:现在是14页\一共有49页\编辑于星期二在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。鉴别培养基伊红和美蓝培养基大肠杆菌伊红和美蓝培养基菌落呈深紫色，并带有金属光泽代谢产物例：现在是15页\一共有49页\编辑于星期二选择培养基:在培养基中加入（缺少）某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。用以菌种的分离。4.培养基的种类鉴别培养基:在培养基中加入某种指示剂或化学药品。用以菌种的鉴别。③按用途不同划分:例：大肠杆菌伊红和美蓝培养基菌落呈深紫色，并带有金属光泽代谢产物现在是16页\一共有49页\编辑于星期二利用拓印法选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌。培养基中加氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌选择培养基培养基+氨苄青霉素培养基没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰怎样选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌?现在是17页\一共有49页\编辑于星期二加入青霉素的培养基：加入高浓度食盐的培养基：不加氮源的无氮培养基：不加含碳有机物的无碳培养基：分离出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)分离出金黄色葡萄球菌（高浓度食盐能杀死多种微生物）分离出固氮菌（非固氮菌因缺少氮源被淘汰）

分离出自养型微生物（异养微生物因缺少有机物被淘汰）以下选择培养基可以分离的微生物？现在是18页\一共有49页\编辑于星期二牛肉膏蛋白胨培养基

是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。分析营养构成？培养基组分提供的主要营养牛肉膏5g蛋白胨10gNacl5gH2O定容至1000ml琼脂20.0g1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方碳源、氮源、磷酸盐和维生素氢元素、氧元素无机盐碳源、氮源和维生素凝固剂现在是19页\一共有49页\编辑于星期二2.无菌范围：实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验操作过程:酒精灯火焰旁操作超净工作台二、无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。防止外来杂菌的污染1.无菌的意义：现在是20页\一共有49页\编辑于星期二二、无菌技术消毒：用温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢、孢子）的过程。3.无菌的方法：灭菌：以强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子）

，达到完全无菌的过程。泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。消毒与灭菌芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。

芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。孢子细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。现在是21页\一共有49页\编辑于星期二(1)消毒的方法：①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min②巴氏消毒法：(低温消毒法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法,现在常常被广义地用于定义需要杀死各种病原菌的热处理方法)70-75℃下煮30min或80℃下煮15min③化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源④紫外线消毒：对实验室空气消毒现在是22页\一共有49页\编辑于星期二①灼烧灭菌：微生物学实验室的接种环、接种针、试管口等的灭菌(2)灭菌的方法：现在是23页\一共有49页\编辑于星期二②干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。适用于玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)和金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌。

(2)灭菌的方法：现在是24页\一共有49页\编辑于星期二③高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。(2)灭菌的方法：现在是25页\一共有49页\编辑于星期二类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体70～75℃煮30min或80℃煮15min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线房间、仪器设备紫外线照射30min灼烧灭菌接种工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热1～2h高压蒸汽灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121℃,15～30min3.无菌的方法：消毒与灭菌现在是26页\一共有49页\编辑于星期二1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿。

。（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管。

。（3）实验操作者的双手。

。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。旁栏思考灭菌灭菌消毒3.使用后的培养基丢弃前应怎样处理？使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。现在是27页\一共有49页\编辑于星期二微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存三、实验操作大肠杆菌的纯化培养㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌例如：现在是28页\一共有49页\编辑于星期二1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g1.计算：培养基用量依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂、搅拌→补水定容4.调pH、分装、封口：5.灭菌：6.倒平板：加棉塞、包牛皮纸、橡皮筋勒紧培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算称量溶化调节pH灭菌倒平板无菌检查现在是29页\一共有49页\编辑于星期二计算称量溶化调节pH灭菌倒平板无菌检查12342.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。3.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立即盖上皿盖。4.等待平板冷却凝固（约需5～10min）。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。1.将培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。倒平板注意事项：①温度：50℃左右②操作：在酒精灯火焰附近③冷凝后平板倒置防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基7.无菌检查：37℃的恒温箱中培养12h～24h

，无杂菌污染才可用来接种.

培养基灭菌后，需冷却到什么时候，才能用来倒平板？约50℃为什么这样操作？为什么平板需倒置？现在是30页\一共有49页\编辑于星期二1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。答：将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。3.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？现在是31页\一共有49页\编辑于星期二单个细胞单个菌落从混杂的微生物群体中获得只含某一种微生物的过程。何为分离纯化？如何纯化？什么是菌落？微生物群分散或稀释（二）纯化大肠杆菌

原理：在培养基上，将细菌分散或稀释成单个细胞，使其长成单个菌落。现在是32页\一共有49页\编辑于星期二单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.功能：1.定义：菌落鉴定菌种的重要依据（微生物的菌落特征因种而异）

固体培养基上大量繁殖子细胞群体现在是33页\一共有49页\编辑于星期二单个细胞单个菌落从混杂的微生物群体中获得只含某一种微生物的过程。何为分离纯化？如何纯化？平板划线法如何分散成单个细胞？稀释涂布平板法微生物群分散或稀释（二）纯化大肠杆菌

原理：

接种方法（纯化方法）在培养基上，将细菌分散或稀释成单个细胞，使其长成单个菌落。现在是34页\一共有49页\编辑于星期二分区划线法连续划线法（1）概念与原理：聚集的菌群连续划线稀释分散单个细胞单个菌落生长繁殖1、平板划线法现在是35页\一共有49页\编辑于星期二(2)“平板划线”实验操作1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。2、在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞3、将试管口通过火焰.4、将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液.5、将试管通过火焰，并塞上棉塞.6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。8、将平板倒置放入培养箱中培养。划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。现在是36页\一共有49页\编辑于星期二第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌分区划线法12345①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.②划线首尾不能相接③每次划线前接种环进行灭菌④划线后,培养皿倒置培养平板划线法注意事项:现在是37页\一共有49页\编辑于星期二（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上原有微生物问题讨论灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后现在是38页\一共有49页\编辑于星期二（2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。（3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。问题讨论现在是39页\一共有49页\编辑于星期二3个划线平板1个不划线平板（重复实验）（空白对照）（3）培养放入37℃恒温箱中培养12h～24h现在是40页\一共有49页\编辑于星期二①系列稀释操作：②涂布平板操作：(1)概念与原理：聚集的微生物单个细胞菌液梯度稀释单个菌落涂布平板(2)操作：生长繁殖2、稀释涂布平板法涂布器现在是41页\一共有49页\编辑于星期二①系列梯度稀释操作9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水注意：移液管需要经过灭菌；试管口和移液管离火焰1～2cm处。现在是42页\一共有49页\编辑于星期二1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按101～106顺序编号。2、用移液管吸取1ml菌液，注入101倍稀释的试管中。使菌液与水充分混匀。依次类推，直至完成最后一支试管的稀释。注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1∽2cm处。微量移液器①系列梯度稀释操作101