梯度洗脱和多组分含量测定

梯度洗脱和多组分含量测定第1页，共38页，2023年，2月20日，星期五1梯度洗脱的原理及应用2梯度洗脱方法的建立3注意事项主要内容梯度洗脱Part1第2页，共38页，2023年，2月20日，星期五存在的问题早流出峰的分离度差；迟流出峰的峰宽增加而峰高降低；由于k范围宽，所以分析时间长；强保留组分造成柱污染.等度洗脱Isocraticelution

-在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变。1梯度洗脱的原理及应用Part1梯度洗脱第3页，共38页，2023年，2月20日，星期五梯度洗脱Gradientelution

-在分离过程中改变流动相组成.优点

改善分离度提高检测性能能够分离复杂样品缩短分析时间降低由于强保留组分而使色谱柱性能变差的可能性1梯度洗脱的原理及应用Part1梯度洗脱第4页，共38页，2023年，2月20日，星期五梯度洗脱原理：

在液相色谱中用2种（或2种以上）不同极性的流动相，在分离过程中按一定的比例连续的变化，通过自身配比的改变而改变其极性，以实现对复杂物质的分离。Time（min）流动相强度增加k值减小（）梯度运行过程中会发生1梯度洗脱的原理及应用Part1梯度洗脱第5页，共38页，2023年，2月20日，星期五等度洗脱梯度洗脱化合物流出加快

色谱峰变窄色谱峰尾部处于高比例有机相环境中，尾部的速度要比峰中心快，从而使峰聚焦，色谱峰变窄。30%B30%B31%B30%B梯度运行过程中会发生1梯度洗脱的原理及应用Part1梯度洗脱第6页，共38页，2023年，2月20日，星期五梯度洗脱的应用

具有较宽k值范围的样品;

大分子样品;

样品含有晚流出干扰物;

溶于弱溶剂的样品稀溶液。1梯度洗脱的原理及应用Part1梯度洗脱第7页，共38页，2023年，2月20日，星期五梯度洗脱的应用1梯度洗脱的原理及应用二烷基邻苯二甲酸酯混合物；C8柱（25×0.46cm，5μm）；流动相：乙腈（B）-水。Part1梯度洗脱1

具有较宽k值范围的样品（即等度条件下不可能使所有谱峰达到0.5<k<20）.运行时间11min，谱峰窄，利于准确定量。第8页，共38页，2023年，2月20日，星期五梯度洗脱的应用注意：梯度洗脱并不能解决所有谱峰的拖尾问题。（a）（b）离子交换色谱分离芳香羧酸混合物（a）55mM硝酸钠水溶液流动相的等度分离；（b）10→100mM硝酸钠水溶液流动相的梯度洗脱。k>20的晚流出峰往往会出现较严重拖尾。Part1梯度洗脱1

具有较宽k值范围的样品（即等度条件下不可能使所有谱峰达到0.5<k<20）.1梯度洗脱的原理及应用第9页，共38页，2023年，2月20日，星期五梯度洗脱的应用大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）的等度保留往往对于流动相组成（%B）的微小改变极其敏感，难以将保留值控制在合适的范围内。例如丙醇-水流动相等度RP-LC分离碳酸酐酶（一种分子量29000Da的蛋白质）时，仅改变±0.1%B，则会导致保留时间±20%的变化。当用梯度洗脱代替等度条件时，HPLC分离大分子时也会使峰形有较大改善。2大分子样品（如分子量大于1000，尤其是生物样品）。Part1梯度洗脱1梯度洗脱的原理及应用第10页，共38页，2023年，2月20日，星期五1梯度洗脱的原理及应用梯度洗脱的应用图为对单一化合物定量的等度分离，但晚流出物的干扰峰仍连绵不断。而梯度洗脱可以通过在下一次进样前将这些晚流出峰快速洗脱出。t（min）t（min）等度洗脱梯度洗脱3样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。Part1梯度洗脱第11页，共38页，2023年，2月20日，星期五1梯度洗脱的原理及应用梯度洗脱的应用对于溶解于弱溶剂中的稀样品，梯度洗脱可以采用大体积（如1~10ml）进样，样品进样时仅与弱溶剂A混合，在进样过程中于柱入口处完成柱上浓缩，而不会引起峰展宽。等度洗脱也可以进行相似的柱上浓缩，但是由于进样过程中样品与较强的等度流动相混合，使样品体积过大，引起样品峰严重展宽，不适合大体积进样。4溶于弱溶剂的样品稀溶液（如用反相柱分离的样品水溶液）。Part1梯度洗脱第12页，共38页，2023年，2月20日，星期五2梯度洗脱方法的建立有机溶剂初始组成梯度时间梯度陡度梯度形状流速柱长柱重新平衡时间必须确定:

2.1选择梯度条件2.2改变峰间距2.3调整色谱柱条件方法建立的基本步骤第13页，共38页，2023年，2月20日，星期五2梯度洗脱方法的建立5%有机相100%有机相初始梯度实验-一个平缓的梯度（60min）2.1选择梯度条件A：梯度变化速率Part1梯度洗脱第14页，共38页，2023年，2月20日，星期五B：梯度范围起始%B与终止%B的最佳值可由表1估计出。然后通过“试-凑”实验，进一步优化梯度范围。tRa或tRz（min）起始%B终止%B5314101122151930202738253546304354355160405968456776507584558310060d可能需要正相柱表12.1选择梯度条件Part1梯度洗脱第15页，共38页，2023年，2月20日，星期五B：梯度范围梯度分离与初始流动相组成（%B）的关系足够大的初始%B值主要影响前部分谱峰：k值降低；峰变窄；分离度降低.相同色谱柱，流速，柱温，梯度变化速率2%/min2.1选择梯度条件Part1梯度洗脱第16页，共38页，2023年，2月20日，星期五B：梯度范围箭头为梯度完成时间如梯度过早结束（末峰离开柱之前），通常会增加运行时间，并使后面谱峰变宽（检测灵敏度下降）相同色谱柱，流速，柱温，梯度变化速率2%/min2.1选择梯度条件梯度分离与终止流动相组成（%B）的关系Part1梯度洗脱第17页，共38页，2023年，2月20日，星期五C：梯度形状的影响梯度形状

较陡的梯度可用于色谱图峰分离宽阔的部分（以节省时间）；较平坦的梯度可用于色谱图峰重叠拥挤的部分（以提高分离度）。线性折线形凹形凸形2.1选择梯度条件Part1梯度洗脱第18页，共38页，2023年，2月20日，星期五C：梯度形状的影响经过初步分离，一般可能得到3种分离色谱图：①前重叠，后分离，保留时间太长；

②前分离，后重叠；③前后分离，中间重叠。2.1选择梯度条件Part1梯度洗脱第19页，共38页，2023年，2月20日，星期五2.2改变峰间距A：改变梯度变化速率（%B）-改变选择性最有效的方法平坦梯度时峰3和4的分离最佳，而峰14和15则更适于较陡梯度分段梯度（折线形）梯度变化速率和形状使分离发生很大改善8.6%/min3.0%/min4.8%/minPart1梯度洗脱2梯度洗脱方法的建立第20页，共38页，2023年，2月20日，星期五B：改变溶剂类型-对于中性样品来说，改变有机溶剂可以改变选择性前面峰对（2╱3）适合于乙腈洗脱，而后出峰对（8╱9）适合甲醇洗脱。应增大甲醇╱乙腈比例的梯度Part1梯度洗脱2梯度洗脱方法的建立2.2改变峰间距第21页，共38页，2023年，2月20日，星期五C：其他条件-主要针对离子样品

pH离子对试剂的浓度温度Part1梯度洗脱2梯度洗脱方法的建立2.2改变峰间距第22页，共38页，2023年，2月20日，星期五2.3调整色谱柱条件当针对参数k*和α（选择性）优化了保留值以后（包括可能采用分段梯度），再改变柱长、固定柱颗粒大小和流速等柱条件，还可进一步改善分离。Part1梯度洗脱2梯度洗脱方法的建立第23页，共38页，2023年，2月20日，星期五5%/min1ml/min->5%/ml5%/min2.5ml/min->2%/ml改变流速Part1梯度洗脱2梯度洗脱方法的建立2.3调整色谱柱条件第24页，共38页，2023年，2月20日，星期五4.6x50mm

1. GLY-TYR 2. VAL-TYR-VAL 3. [GLU]-ß

蛋白质

AMYLOIDFRAGM1-16 4. [TYR8]血管舒缓激肽 5. MET-ENK 6. 亮氨酸脑菲肽 7. 血管紧张肽II 8. KINETENSIN 9. 核糖核酸酶 10. INS(EQUINE)4.6x150mm124568910k*=2.5k*=2.6k*=4.5k*=5.9300SB-C8,3.5µm梯度: 2-75%Bin30min.流动相: A=5:95,ACN:H2O0.1%TFA B=95:5,ACN:H2O0.085%TFA流速: 1mL/min.进样: 10µL,每种组分2.6µg温度: 35°CUV: 215nm梯度陡时,使用短色谱柱(降低Vm)常常能改善分离度。73Part1梯度洗脱2梯度洗脱方法的建立2.3调整色谱柱条件第25页，共38页，2023年，2月20日，星期五正确的柱长是多少?在允许的时间内获得最大分离：分析时间短-短柱，高流速分析时间长-长柱，正常流速Part1梯度洗脱2梯度洗脱方法的建立2.3调整色谱柱条件第26页，共38页，2023年，2月20日，星期五3梯度洗脱注意事项（1）注意各溶剂间的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。例如：a乙腈和1mol/L的醋酸铵做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶。b甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。c有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。一般我们用的盐浓度不超过0.2mol/ml，浓度太过容易析出，则有机相比例不得高于60%。（2）对溶剂的纯度要求更高（影响重现性）。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辩认溶剂杂质峰。（3）注意梯度变化时系统压力的变化，防止超出限度。Part1梯度洗脱第27页，共38页，2023年，2月20日，星期五3梯度洗脱注意事项（4）每次梯度洗脱之后必须使色谱柱恢复到初始的状态。需让约10倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。（梯度周期）（5）低压梯度要注意脱气，混合后容易产生气泡。

用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。（6）容易出现鬼峰，应作空白试验。第一针一般不要，空白多做几次，是两次空白重合为止。进空白能帮助你清楚了解产生的峰到底是样品中的还是溶剂中的。（7）管路及柱子做梯度前要彻底的冲洗干净，防止空白中过多鬼峰的出现。Part1梯度洗脱第28页，共38页，2023年，2月20日，星期五3梯度洗脱注意事项（8）梯度选择时尽量几相之间相变化要小,否则不易平衡。（9）梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。（10）要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出。（11）使用缓冲盐体系是需要注意切换时的过渡问题。

如果是缓冲盐体系，一定要用大比例水好好的把柱子冲一下。另外，即使不使用含盐的体系，也有可能出现梯度过程中两相不混溶的问题，导致带来的一系列异常情况的发生。所以应对各流路流动相性质作了解，注意溶解范围以及梯度进行的速率等情况。Part1梯度洗脱第29页，共38页，2023年，2月20日，星期五Part2中药多组分含量测定第30页，共38页，2023年，2月20日，星期五中药多组分含量测定中药成分复杂,药效部位不是单一成分,而是多种成分的混合物。在中药制剂中,单一成分不能反映复方制剂的质量,也并不能保证产品质量上的均一性。利用复方制剂中某几个有效成分作为指标，通过同步测定,可以实现对多味药材的多个成分含量测定,并更准确表达中药的质量内涵。Part2中药多组分含量测定第31页，共38页，2023年，2月20日，星期五1查文献、看药典2确定色谱条件和供试品制备方法3进行方法学验证4进行含量测定中药多组分含量测定

确定待测的有效成分（或指标性成分）；了解这些成分的理化性质；熟悉样品提取的大概方法。第32页，共38页，2023年，2月20日，星期五2确定色谱条件和供试品制备方法供试品制备方法的确定：

评价方法：a1个或多个指标成分的含量；b出峰情况（出峰个数和峰形等）。筛选供试品制备方法时可能用到的实验优化方法：单因素设计正交设计均匀设计响应曲面法确定色谱条件：

用混合对照品摸色谱条件

R＞1.0即可；fs尽量在0.95~1.05。

用样品摸色谱条件

满足系统适用性试验要求Part2中药多组分含量测定第33页，共38页，2023年，2月20日，星期五3方法学验证内容验证的内容Part2中药多组分含量测定3.1标准曲线和线性3.2专属性3.3精密度3.4重复性3.5稳定性3.6回收率3.7耐用性3.8定量限第34页，共38页，2023年，2月20日，星期五3.1标准曲线和线性

分别精密量取一定体积的混标对照品储备液，配成6份浓度不同的混和对照品溶液。按照确定的色谱条件进样,测定各对照品的峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C,mg·mL-1）为横坐标,绘制标准曲线。确定线性范围及r值。注意：a：先粗测样品各物质含量（如A物质含量为0.05mg·mL-1），将这个含量作为线性中间点(混标中A物质的浓度可配成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10mg·mL-1)；b：混标中各物质间的相对含量要尽量与样品中的相对含量一致；c：Y=ax+b（r≥0.999），当a＞100b时，可用外标一点法(因为这是含量和响应成正比)定量，否则用就用标准曲线法；d：测含量时不应超出此范围，标曲范围不能延长。Part2中药多组分含量测定3方法学验证内容第35页，共38页，2023年，2月20日，星期五3.2专属性除去含待测成分药材，模拟处方制备中药制