徕卡显微镜惠更斯STED反卷积快速指南

STED本文档的目的是给STED用户简要介绍了使用与LeicaTCSSTEDSP83倍显微镜获得的图像惠更斯专业解卷积图像。1〔从左至右〕：共焦;受激放射损耗;受激放射损耗反褶积参数编辑器〔在图像的缩略图右键点击〕图2：概述惠更斯图像参数编辑器。这个窗口可以访问所需的受激放射损耗解卷积图像的全部相关图像参LIF文件，大局部参数都自动从元数据提取〔见惠更斯Pro用户指南从SVI更多信息〕。显微镜类型：值从图片属性取数值孔径：数值从图片属性取客观质量：取默认值“好”盖玻片位置：使用专用工具〔图示左侧〕拍摄方向：对于DMI显微镜总是“向上”针孔间距：不相干的共焦/STED显微镜镜片浸泡：用“油”包埋剂：从下拉菜单中选择适宜的媒介。激发波长值从图片属性取发光波长值从图片属性取多光子激发：值从图片属性取激发填充因子：从图片属性获得的值;默认值=2，除了TiSaph受激放射损耗〔值=1.2〕受激放射损耗耗尽型：从图片属性获得的值STED饱和系数：见下面的更多细节受激放射损耗波长值从图片属性取受激放射损耗免疫力分数：见下面的更多细节3X：请参阅下面的具体资料饱和因素原本是指期限：这是受激放射损耗区分率公式的一局部：STEDPSF的全宽半高〔FWHM〕，STED激放射损耗和TCSSTEDSP83X〔主要依靠于激光强度和所选择的染料的消耗效率〕的实施是由包括关于鼓励和损耗激光模式〔附加信息扩展脉冲或CW〕和门控检测。在实践中，有两个参数影响STED的区分率，因此惠更斯饱和系数：STED于受激放射损耗PSF在惠更斯的计算只有一个“抱负”染料的ISATLASAF版本后，推测值〔来自成像参数〕会自动在图像属性中设置并转移到惠LIF的是在LASAF的早期版本中获得的文件，饱和度的因素需要在惠更持眼睛上的图像区分率〔线剖面测量〕示一个阵列示出了饱和度因子与几种计算出的PSF的FWHM值之间的关系。它应当1。饱和因子值和现实之间显著的差异可以在反褶积的数据进展分析：3：一个数列计算的PSF汇编〔->PSF〕具有不同的饱和度因子〔SF〕呈现增加〔但不〔FWHM〕15纳米。饱和因子值和现实之间显著的差异可以在反褶积的数据进展分析：PSF是比真实的PSF显著较小。这将导致在工件视为不与原〔〕。在一般状况下，过小的点扩展函数的推测将会对数据不太明显的影响，但小斑点和纹理可被误判为构造细节和结果在成像数据的错误会释。 STED反卷积向导STED反卷积向导〔见下文的工件生成一个巨大的损失〔箭头，见下文〕。图5：对图像质量设置得太低饱和度的因素。箭头表示显示哪些可以在原始数据清楚地识别显子构造的丧失斑点。图4〔噪声放大和过度造粒和构造的反差图4〔噪声放大和过度造粒和构造的反差。LIF文件的图片属性提取正确的值。不过也有一些事情要考虑。在3D滑块调整光的进入既可以通过“旋涡“3D甜甜圈”光束的路径，这将对横向和轴向区分率的增加之间的比率产生影响的百分比。PSF具有一样饱和度的外形依据三维滚动条的位置而变化。横向区分率不断减小，而轴向区分率的增加〔见例计算的PSF630饱和值〕。3D滑块百分比之间的比率又是依靠于所选择的染料的受激放射损耗效率。6：在惠更斯编译生成不同的PSF计算的〔操作窗口->PSF〕3DSTED光路之间的再安排的轴向和横向半高宽之比显著变化。像素尺寸：15纳米×40纳米〔XY〕。3DSTED正确的饱和系数的最简洁的方法在于获得一个额外的掌握图像和0％STED3D和调整惠更斯饱和因素对测量FWHM。一样的饱和度因子然后可以只要同一STED激光强度和栅极启动值被使用用于全部三维STED滑块的位置。受激放射损耗免疫力分数“免疫分数”可以被描述为被添加到纯STEDPSF一个附加的共焦聚砜组分的人口给出。图7：两个受激放射损耗的PSF比较。在左边的“纯”受激放射损耗PSF0％的免疫力分数。在15％的免疫馏分产生的一样的PSF15纳米。这里，免疫分数是一个广泛的定义，旨在掩盖三个不同的受激放射损耗的影响：反斯托克斯鼓励与受激放射损耗损耗激光： /激/激徕卡的推举染料/激光组合通常有没有只格外少的反斯托克斯鼓励，但在某些状况下〔多色试验〕，STED耗尽激PSF脚印的额外的增加可以通过增加免疫分数来模拟。留意，受激放射损耗消耗激光器具有不同PSF的外形〔面包圈〕，以有一个固定的激发激光〔点〕，这是没有考虑到在免疫分数的计算。短寿命成分在STEDCW和门控STED：CW受激放射损耗损耗增加荧光寿命到受激放射损耗PSF，这偏见区分率朝放射较STEDCWPSF“免疫”的受激放射损耗光，这会导致类似PSF7B5％的范围内。3.可怜的损耗效率脉冲受激放射损耗：在大多数状况下，脉冲受激放射损耗的解决方案为您供给了STEDPSF的清洁形式。然而，由于同步问题，本征染料光物理学和宽度STED激光脉冲，染料的人口可能不被有效地耗尽，并且每个定义免疫耗竭激光。受激放射损耗PSF受激放射损耗PSF〔强反斯托克斯激发和STEDC调整计算PSF增加的信息可以提取/从原始图像增加的量。PSF免疫力分数格外低的水平会使该算法无视了真实的PSF，这可以通过软件作为一个真正的信号最终被误判的基座，并会最终导致文物，像小边强的信号放大构造图像。结论匹配计算，理论PSF，以“真正的”的设置试验之间的差异在PSF外形是微乎其微的。此外，随着越来越多的阅历，这些调整变得随着时间的推移更加简洁。FWHM“FWHMPSF估量”所在的“分析”一节中给定的图像与单一的PSF可见的自动生成的FWHM显微镜的任一对格外小的荧光珠〔<35纳米〕或者甚调整所计算PSF的图像参数。一个更优雅，也更先进的解决方案是由“PSF”的“”一节中找到提供。此处的实际的PSFPSF解卷积的数据-噪声水平的图像正确地提取所需的信息。解卷积精灵〔图片缩略图右键点击〕全部图片属性现在可以正确地设置，接下来的步骤包括使用反卷积向导的最终的图像引导。的SVI〔网站上的局部的去卷积步骤和图像处理工具，在惠更斯软件的完整描述可以的“>”中的”。在这个快速指南只有最相关的步骤将包括生成高质量的图像和避开最常见的器物。PSF/负载卷积模板8：加载卷积模板和文件的特别专业效劳公司。在这个步骤中，用户被要求加载之前保存的卷积模板并导入从前计算，或蒸馏水PSF在这个步骤中，用户被要求加载之前保存的卷积模板并导入从前计算，或蒸馏水PSF〔参见参数编辑器以上〕自动生成计算PSF。请留意，反褶积精灵还供给了扩展的帮助文件〔8，9，1012的黄色文本框〕，并直接链接到SVI卷积试验，这一步可以无视不计。裁剪工具图9：裁剪图像，以削减数据量，提高卷积速度。在这其次步骤中，用户被赐予时机来移除图像的空的区域，以供给更有效和更快的去在这其次步骤中，用户被赐予时机来移除图像的空的区域，以供给更有效和更快的去“”选项将自动生成建议裁剪边界，这进一步增加了易用性。直方图工具和背景估量图10：剪切光明的信号和背景估量是反褶积至关重要的参数。说，格外光明的图像包含的区域，其中像素的强度到达最大值〔在8位图像，255〕的“饱和”的区域由强度分布图中给出的构造信息丧失〔削波〕，这将导致伪因此要避开削波是很重要的。高，真实的信号可以被无视和压制，这可能导致信息丧失。图11：反卷积的图像与不同背景确实定电平设置〔=0;背景=15;背景=30〕。不同的背景值显示不准确的估量的影响。在过低的水平〔0〕的噪声被解释为信号而导致强伪影的产生，而高背景估量〔30〕，使构造信息丧失。”搜寻图像为平坦区域具有最低的像素值，而“中/”搜寻对象，并确定在这些对象中的直接靠近的背景。因此，“最低”的算法一般会产生较低的背景水平比“中/”假设需要的话，还有一个选项，解卷积阶段1212：设置反褶积参数。最大迭代次数：在惠更斯默认CMLE最大迭代次数：在惠更斯默认CMLE个迭代。更多的反复测试，更好的图像将被反卷积。在“反褶积强度”可以其特征对40，用于共焦和受激放射损耗的图像。耗的图像。信号噪声比〔SNR〕：信号-噪声比设置掌握很屡次迭代之后可到达的最大区分率，因此，有对对象的清楚度的影响。1313-噪声电平设置〔原始图像，SNR=2;SNR=12，SNR=40〕。SNR值对对象的锐度的效果。以低水平〔2〕的构造似乎比在原始图像稍大。具有高SNR值〔40〕中的对象变11。找到正确的SNR1015之间受激放射损耗范围内，但最好是检查这些值真正适合。为此，线轮廓可以在整个图像被创立〔点击并拖动图像上〕，背景估量步骤中输入的那些。默认信噪比被设置为7，用于STED图像和20，用于共焦图象。质量阈值：0.05迭代模式：明智的做法是保持这个在“优化”欲了解更多详情，请参阅本SVI用户指南。砖布局：明智的做法是保持这个在“自动”。欲了解更多详情，请参阅本SVI用户指南。整理步骤图14整理步骤图14：经过去卷积过程完成，该软件供给应检查去卷积的图像，然后重启动过程，假设需要的可能性。