实验三：细菌的分布与消毒灭菌

【目的】

试验三细菌的分布与消毒灭菌菌操作对于微生物学及医学实践的重要性。为正常菌群。③生疏外界因素对细菌的影响，学习常用的消毒灭菌方法。④了解不同细菌对外界因素具有不同的抵抗力。一、细菌的分布检查〔一〕空气中的细菌检查【材料】一般琼脂平板培育基。【方法】5～30min37℃18～24【结果】〔填表10-1〕平板培育基外表或多或少有菌落生长。〔二〕地面水中的细菌检查【材料】地面水(河水、井水或池水)、高层琼脂培育基、1ml无菌吸管、灭菌培育皿。【方法】1ml动，使水与琼脂充分混匀，静凝。③37℃24【结果】〔填表10-1〕〔三〕衣服、票证、头发、手指皮肤上的细菌检查【材料】一般琼脂平板培育基。【方法】取一般平板一个，用蜡笔在平板反面玻璃上划成四等分，并贴上标签(图37℃24【结果】填表培育基外表涂抹处有菌落生长。 衣服票证头发、手指皮肤上的细菌检查〔四〕正常人体咽喉部的细菌检查【材料】血液琼脂平板培育基、灭菌棉拭、接种环、酒精灯。【方法】侧，然后改用灭菌接种环作分别划线接种。盖上皿盖，37℃24〔或者承受咳喋法〕。【结果】〔填表10-1〕的不完全溶血环。此为咽喉部的正常菌群—甲型链球菌。〔五〕试验结果观看(填表)检查材料细菌生长状况菌落个数试验体会

细菌分布的试验结果空气 水 衣角 票证 头发 手指 咽喉部二、消毒灭菌试验〔一〕煮沸与高压灭菌法【原理】DNA菌强，所以只有承受高压蒸气灭菌法才能将芽胞彻底杀灭。【材料】琼脂平板两块、肉汤管两支、大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌肉汤培育物。【方法】①取琼脂平板两块，用记号笔分别在二平板底部玻面上，注明大肠埃希菌100℃10min121℃20min。100℃l0min121℃20min，用毛再用接种环于二支肉汤管的任何一管中取一环菌液接种于大肠埃希菌平板的对l0min121℃20min(1520min24生长状况。【结果观看】〔填表10-2〕表10-2 煮沸和高压灭菌试验结果细菌名称枯草芽胞杆菌大肠埃希菌结果分析

100℃10分钟 121℃20分钟 未加热(对照)〔二〕紫外线杀菌法【原理】DNADNA制，导致细菌死亡。用，应留意防护。【材料】大肠埃希菌培育物、琼脂平板、接种环、酒精灯、紫外线灯。【方法】种。分钟。37℃24【结果观看】〔填空〕平板上用黑纸遮盖局部 菌生长，未遮盖局部 这说明紫外线具有 作用，但力弱。1、皮肤消毒试验【原理】15～3095％的乙醇消毒效果反不如2.5％的碘酒可使菌体酶蛋白中的硫氢基(-SH)性，导致机能障碍而死亡。【材料】一般琼脂平板一个、2.5％碘酒、75％乙醇。【方法】乙醇消毒手指后再各涂37℃24【结果】〔填表〕皮肤消毒试验结果37℃37℃24h结果解释消毒前手指皮肤消毒后手指皮肤比照(不接种)2【原理】能外用。不同细菌对不同的化学消毒剂具有不同的敏感性。【材料】培育液、大肠埃希菌培育液、琼脂平板、无齿小镊子。【方法】4方法与药敏试验相像)三、抗生素的抗菌试验(药敏试验，纸片法)【原理】抗生素主要是指某些微生物(大多数为放线菌和真菌、极少数为细菌)在生长生殖过程中产生的一种合成代谢产物。此种有机化合物具有抗生物作的抗菌试验(药敏试验)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌力气的试验。【材料】①金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、琼脂平板培育基。环。【方法】或将平板底部以蜡笔划为六等分，分别在靠近边缘处注明青、链、氯、庆大等字样〕。②以灭菌接种环挑取菌液，在培育基外表作密集划线接种。15mm，并分别作好标记。90mm)(mm)，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。判定其敏感度。【结果观看记录】填表。药物敏感试验结果推断参考标准：抑菌圈直径抑菌圈直径〔mm〕抗菌药物耐药中度敏感敏感青霉素链霉素其它抗生素＜10＜10＜1010～1210～1410～15≥13≥15≥16表示常规剂量的药物在体内所到达的浓度不能抑制或杀灭待测菌。药物敏感试验(纸片集中法)结果大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌抗生素抑菌圈直径(cm)敏感度抑菌圈直径(cm)敏感度青霉素红霉素庆大霉素先锋霉素先锋霉素氯霉素四、口腔内微生物检查〔口腔专业〕【方法】①滴一滴墨汁于干净玻片的一端；②用牙签取齿间牙垢少许在墨汁中涂匀；③用玻片推成推片，枯燥后油镜观看、绘图。【结果】〔绘图〕 口腔内微生物可见黑色背景中有着色发亮的细菌、螺旋体等微生物。五、常用消毒灭菌器及无菌室介绍(一)高压蒸气灭菌器【构造】高压蒸气灭菌器是双层的金属圆筒，盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气10-5。器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌物品。【用法】20蒸气压力与温度的关系千帕斯卡千克/平方厘米磅/平方吋温度(kPa)(kg/cm2)(lb/in.2)(℃)34.470.355108.855.200.608113.068.940.7010115.6103.501.0515121.3137.801.5020126.2【留意事项】放气减压，以免瓶内液体冲出外溢。等。(二)干热灭菌器(干烤箱)【构造】箱壁为双层，两层间衬以石棉板隔热，底部装有电热线圈，箱壁有温度调整箱内温度渐渐上升，可保持恒温。【用法】源，调整温度(160～170℃)和时间(2【留意事项】180℃，以免烧焦棉塞及包装纸。起玻璃器皿裂开。③干烤灭菌主要应用于玻璃、陶瓷制品、凡士林、液体石蜡等物品。(三)流通蒸气灭菌器其构造原理同一般的蒸锅，底层盛水，器内有一至二层的带孔隔板，以放置待灭菌的物品。加热水后沸腾产生蒸气。在一般大气压下，蒸气温度只能到达100℃，维持此温度30100℃蒸3037℃孵箱培育过夜，使未死亡的芽胞发育成生殖体。如此连续灭菌三次可达灭菌目的。本法用于一些不耐高温的培育基之灭菌。(四)滤菌器滤菌器是用以除去细菌的器具，它含有微细小孔，只允许液体及气体通过，药液、酶制剂等。常用的滤器有蔡氏滤器和玻璃滤器。(五)煮沸消毒器100℃5min刀、注射器)等的消毒。(六)紫外线灯31～2(七)无菌室及无菌工作台的工作原理及使用的操作均应在紫外线消毒后的无菌室或超净工作台内进展。一些不能经受高75％0.1％的十二烷基磺酸钠(SDS)浸泡消毒。1、无菌室 无菌室或称干净室，是在试验室内部安装的与外界隔离的用于30～60min；操作完毕后应擦拭台面，并再经紫外线杀菌灯照耀处理，随时保持室内的无菌状态。可与更衣间为同一间，其间设吹风机、恒温培育箱和小型低速离心机等。2.5m保紫外线的消毒作用。2、无菌工作台 无菌工作台又称超净工作台，系在接种罩的根底上设计出生物颗粒带走，从而形成无尘无菌的工作环境。0.32～0.48m/s2～33台的干净度(≤3.5颗/L)和平板法测定其平均菌落数(≤0.5个/皿时)。当加大风机输入电压已不能使净化工作区平均风速到达规定参数时，应更换高效过滤器。六、医院感染的微生物学监测〔医院见习〕(一)压力蒸气灭菌效果的监测目前应用的压力蒸气灭菌器有两种：一种是一般的下排气式压力蒸气灭菌20min。对于压力蒸气灭菌效果的检查包括：1、操作步骤检查 遵守操作规程，仪表的检查(压力表、留点温度计、温度记录、定时器等)；2、化学指标检查 120℃121～123℃熔解。3、生物指标的监测 为直接检查灭菌效果，通常应用嗜热脂肪芽胞杆菌饱和蒸汽中存活时间≥3～9min，杀灭时间为＜55℃48h且培育基变为黄色则说明有菌生长，灭菌不彻底，需查找缘由并重灭菌。(二)紫外线杀菌效果的监测3米高处，照耀1～2100uW/cm2，使用中灯70uW/cm2照耀强度，监测应每半年一次。生物监测必要时进展，经90.00％105～6／片。(三)消毒剂的使用监测1、消毒剂鉴定试验 包括消毒剂定性试验和消毒剂定量消毒试验。2、消毒剂使用过程中污染菌的监测以及常用消毒剂的中和剂。(四)微生物污染监测1、物体外表细菌污染监测 采样方法为应用大小为5cm×5cm的正方形无108/cm3。计算公式如下：平均平板菌落数×稀释倍采样面积平均平板菌落数×稀释倍采样面积2、空气中细菌监测 室内空气中微生物的发生源主要为人和动物。人可不呼吸道、消化道、皮肤、毛发等排出微生物进入空气中。一般状况下，人体排菌量每分钟不超过1000个，但患者的排泄物和分泌物，如飞沫、痰液等含有大量的病原菌可严峻污染空气和物体外表当人们在进展各种工作时也会污，如医疗操作、医疗用品和卫生用品生产、微生物试验、穿衣、铺床等都可使微生物进入空气中。种消毒措施使用前后的采样及分析，以评价消毒效果。依据采样原理可将采样方法分为沉降、固体撞击、液体冲击和过滤4空气中的气溶胶粒子是沉降法中最简便的方法。【材料】分别培育基：养分琼脂平板、血琼脂平板等。【方法】①采样方法采样时间：选择消毒处理后与操作前期进展。采样高度：与地面垂直高度为80～150cm处。布点方法：室内面积≤30m2时，可设内、中、外对角线3点；内和外部位，lm30m255lm。平皿暴露采样：将培育基平皿翻开，暴露5分钟(亦可5～30分钟)后，盖好37℃24～48皿上的菌落数，按奥氏公式，将所得菌落数计算成浮游菌数，依据公式测算，5100cm210L下：100 5 100 50000NCFU