微生物的鉴定

微生物的鉴定第1页，共51页，2023年，2月20日，星期四微生物的鉴定

实验3-1微生物的形态观察实验3-2细菌特殊结构的观察实验3-3革兰氏染色法实验3-4微生物大小测定与计数实验3-5微生物的理化性能鉴定

第2页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-1微生物的形态观察一、实验目的

1.学习微生物涂片、染色的基本技术。

2.掌握微生物的简单染色法。

3.熟悉细菌、放线菌、酵母菌、霉菌在形态上的主要区别。二、实验原理微生物的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助于染色，使菌体着色以增加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。第3页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-1微生物的形态观察在微生物形态观察中，根据不同的种类，需采用不同的染液和染色方法。染色前必须固定微生物，其目的有二：一是杀死微生物并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法，固定时应尽量维持细胞的原有形态，防止细胞膨胀或收缩。第4页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-1微生物的形态观察三、实验材料

1.菌种与染料根据不同的菌种采用不同的染液，见表3-1和附录Ⅳ。

2.仪器和其他用品显微镜，接种环，解剖刀，镊子，酒精灯，载玻片，盖玻片，石蜡油，吸水纸，擦镜纸。表3-1不同微生物种类所使用的染液

微生物类群细菌放线菌酵母菌霉菌菌种大肠杆菌细黄链霉菌米酒酵母根霉染液番红石炭酸复红吕氏美兰乳酸石炭酸棉蓝第5页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-1微生物的形态观察四、实验方法（一）细菌、酵母菌的染色染色操作程序为：涂片——干燥——固定——染色——水洗——干燥——油镜观察。

1.涂片取干净载玻片，于中央加蒸馏水一小滴，将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后，取试管斜面一支，按无菌操作法用接种环从菌种斜面表面挑取细菌少许(注意不要挑破培养基)，涂在载玻片水滴中，涂面约为1cm2的均匀薄膜。如果是液体培养物则不必加水，直接取菌液1～2环涂片，接种环经灭菌后放回原处。无菌操作及做涂片的过程见图3-1。第6页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-1微生物的形态观察图3-1无菌操作及做涂片的过程第7页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-1微生物的形态观察

2.干燥将涂片自然风干或将载玻片置于酒精灯火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。

3.固定手执涂片一端，有菌膜的一面向上，迅速通过火焰2～3次，使菌体固定于载玻片上，待载玻片冷却后，再加染料。

4.染色将涂片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)番红染液或吕氏美兰染液于菌膜部位，染色1～2分钟。

5.水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自载玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6.干燥和镜检让其自然干燥或用吸水纸吸去载玻片上多余的水分后。先用低倍镜找到物像后再用油镜观察。第8页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-1微生物的形态观察（二）放线菌、霉菌的染色

1.制片及染色用解剖刀从菌落的边缘连同培养基一起挑取少量带有孢子的菌丝，置于载玻片中央，先用另一载玻片使劲挤压有菌部分，使得菌群铺成一薄层，然后将载玻片中央置于酒精灯火焰上方加热，使培养基融化，冷却后，在载玻片的中央有菌部分滴加2滴石炭酸复红或乳酸石炭酸棉蓝染液，再轻轻盖上盖玻片，注意避免产生气泡。

2.镜检先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。五、实验报告绘出所观察到的各种微生物的形态。返回第9页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-2细菌特殊结构的观察

一、实验目的

1.掌握芽孢染色的方法；

2.学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；

3.学习并掌握荚膜染色的基本方法。二、实验原理细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，着色、脱色都比营养细胞困难。芽孢染色法就是根据这一特点设计的：采用一着色力强的染料，并用微火加热，使菌体和芽孢同时着色后再用水洗，使菌体脱色而芽孢仍保留已着的颜色。第10页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-2细菌特殊结构的观察

细菌的鞭毛极细，其直径通常为10～20nm，只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，鞭毛直径加粗，然后再进行染色。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖、糖蛋白或多肽，荚膜与染料之间的亲和力弱，不易着色，且可溶于水，易在水洗时被除去。但荚膜的通透性较好，一些染料可透过荚膜而使菌体着色，故常采用负染色法，使菌体和背景着色，荚膜不着色；因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。荚膜很薄，含水量又高(90%以上)，故染色时不用热固定，以免荚膜皱缩变形。第11页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-2细菌特殊结构的观察

三、实验材料

1.菌种根据观察目的的不同，选用不同的实验菌种，见表3-2。

2.染料及试剂孔雀绿染色液，硝酸银鞭毛染色液，黑色素水溶液（见附录Ⅳ），番红溶液，甲醇。

3.仪器和用品显微镜，木夹子，载玻片，酒精灯等。表3-2细菌特殊结构观察所选用的菌种

观察目的芽孢鞭毛荚膜实验菌种枯草芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌褐球固氮菌第12页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-2细菌特殊结构的观察

四、实验方法（一）芽孢的染色

1.涂片取培养24h左右的枯草杆菌，涂片、干燥、固定。

2.初染加3～5滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上，用木夹夹住载玻片，用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热中应随时注意补加染液，切勿使标本干涸。

3.水洗待玻片冷却后倾去染液，水洗至不再褪色为止。

4.复染加番红液1滴，染色1min，水洗。

5.镜检干燥后用油镜观察。第13页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-2细菌特殊结构的观察

（二）鞭毛染色

1.菌种的准备冰箱保存的菌种要连续移种1～2次，取新配制的营养琼脂斜面接种，28～32℃培养10～14h。

2.载玻片的准备玻片要求光滑，洁净，忌带油迹。将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后置于95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。

3.菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。第14页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-2细菌特殊结构的观察

4.制片取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温(或37℃温箱)自然干燥。

5.染色涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。

6.镜检干后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形。第15页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-2细菌特殊结构的观察

（三）荚膜染色

1.制片在载玻片一端加一滴无菌水溶液，取少许培养72h的褐球固氮菌，在水滴中制成菌悬液，取一滴碳素绘图墨水与菌悬液充分混匀。另取一块载玻片作推片，将推片一端平整的边缘与菌液以300角接触后顺势将菌液拉向前方，使其涂成一薄膜，风干。

2.固定用纯甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇，文火干燥，勿使玻片发热。

3.染色滴加番红溶液，染色1～2min，细水流适当冲洗，自然干燥。

4.镜检背景黑灰色，荚膜呈一清晰透明圈，菌体红色。

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实验3-2细菌特殊结构的观察

五、实验报告

1.绘图表示枯草芽孢杆菌茵体的形状与芽孢的形状、大小及其着生位置。

2.绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。

3.绘图说明你观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。返回第17页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-3革兰氏染色法

一、实验目的

1.了解革兰氏染色的原理。

2.掌握革兰氏染色的方法。二、实验原理革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色，故又叫复染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌分为两大类，菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革兰氏阴性菌。第18页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-3革兰氏染色法

其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，交联度大，类脂质含量低，经用乙醇（或丙酮）脱色等处理主要发生脱水作用，而使孔径缩小，通透性降低，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色，结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来，用番红复染后，细胞被染上红色。第19页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-3革兰氏染色法

三、实验材料

1.菌种大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。

2.染料和器材显微镜，载玻片，草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液（见附录Ⅳ），95%乙醇，番红染液，香柏油，二甲苯，擦镜纸。第20页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-3革兰氏染色法

四、实验方法

1.涂片挑取少许大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别涂片(涂片一定要非常薄)。也可采用“三区”涂片法：在玻片中央偏左和偏右方各加一滴无菌水，先挑取少量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在左右一方分别涂片后，再将左右方的菌液延伸于中间区，使大肠杆菌、金黄色葡萄球菌相互混合。

2.干燥室温自然干燥。

3.固定涂面朝上，在火焰上过2～3次。第21页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-3革兰氏染色法

4.染色(图3-3)

(1)初染加草酸铵结晶紫染色液一滴，染色1～2min，水洗。

(2)媒染滴加卢戈氏碘液冲去残水，覆盖约1min，水洗。

(3)脱色斜置玻片于一烧杯上方，并在载玻片背面衬一白纸，滴加95%乙醇脱色，并轻轻摇动载玻片，直洗至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约0.5min)。立即用水洗净乙醇，并轻轻吸干。

(4)复染加番红染液一滴染色2min，水洗。第22页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-3革兰氏染色法

实验图3-3革兰氏染色程序1.加草酸铵结晶紫染1～2分钟；2.水洗；3.加碘液媒染1分钟；4.水洗；5.乙醇脱色约30s；6.水洗；7.番红复染约2分钟；8.水洗。第23页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-3革兰氏染色法

5.干燥先用吸水纸轻轻吸干，再晾干。

6.镜检先用低倍镜找到物像后，用油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。五、实验报告简述观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘图（说明各菌的形态、颜色和革兰氏染色反应）。返回第24页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

一、实验目的

1.了解用测微尺测定微生物大小的方法；

2.了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。二、实验原理微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形的玻片，在载玻片中央有一条把5mm长度刻成50等分或把10mm长度刻成100等分的线(图3-2)。第25页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

测量时，将其放在接目镜隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物像。目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数的不同而异。即目镜测微尺上的刻度只是代表相对长度，所以在使用前须用镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的长度。镜台测微尺是一个中央部分刻有一条长为lmm刻度的载玻片(比一般载玻片厚)，其上镶有一圆形玻片，其中lmm的刻度被精确等分为100小格，每格长0.01mm(图3-3)。因此长度固定不变，所以用镜台测微尺的已知长度，在一定放大倍数下，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度(图3-4)。第26页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

图3-2目镜测微尺图3-3镜台测微尺图3-4镜台测微尺校准目镜测微尺情况第27页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

血球计数板可用于计数一定体积内的微生物个体数量。血球计数板是一块特制的载玻片，玻片上有4条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央lmm2面积上刻有400个小方格(见图3-5)。第28页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

图3-5血球计数板的构造

1-盖玻片2-计数室第29页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

血球计数板有两种规格，一种是将lmm2面积分为25个大格，每个大格再分为16个小格(25×16)。如在血球计数板上刻有一些符号和数字(见图3-5a)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25大格：即0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；(1/400)mm2表示计数室面积是lmm2，分400个小格，每小格面积是(1/400)mm2。另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(16×25)。两者都是总共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3(10-4mL)的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出lmL菌液所含的菌体数(见图3-6)。第30页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

图3-6两种不同刻度血球计数板的构造第31页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

三、实验材料

1.标本酿酒酵母，枯草杆菌染色标本片。

2.仪器和用品显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，移液管，香柏油，二甲苯，盖玻片，擦镜纸等。四、实验方法（一）微生物大小的测定

1.目镜测微尺的校正（1）将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；（2）把物测微尺放在载物台上，使刻度朝上，对准聚光器。第32页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

（3）先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后转换高倍镜，再次调焦看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。（4）记录两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各有若干格。各种放大倍数各测量3次，取其平均值。（5）因为镜台测微尺的刻度每格10µm，所以由下式计算出用低倍镜、高倍镜和油镜观察物体时，目镜测微尺每格的实际长度。第33页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

（6）移去镜台测微尺，并将其洗净、晾干，放回盒内。

例如，目镜测微尺5小格等于镜台测微尺2小格，则目镜测微尺上每小格长度为：2×10／5=4µm

用同法校正在油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度)进行，而且只能在特定的情况下重复使用。第34页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

2.菌体细胞大小测定

(1)取一张干净的载玻片，滴上一滴棉兰染色液或路戈氏碘液。

(2)用接种环无菌操作取酵母菌少许制成水浸标本片。

(3)取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格(不足1格的部分估计到小数点后l位数)。测出的格数乘上目镜测微尺每格代表的长度即等于该菌的大小。第35页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

一般测量菌体的大小要在同一涂片上测定10～15个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且是用对数生长期的菌体进行测定。

3.用同法在油镜下测定枯草杆菌染色标本的长和宽。

4.用毕后，取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，用擦镜纸擦去目镜测尺的油腻和手印，擦好油镜头。第36页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

（二）微生物的计数

1.稀释样品，为了便于计数，将样品适当稀释，使每格约含4～5个细胞。

2.取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置5～10min即可计数。

3.将血球计数板置于载物台上，用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动微调节器，以便看到计数室内不同深度的菌体。第37页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

现以16×25规格的计数板为例，数四个角（左上、右上、左下、右下）的四中格（即100小格）的酵母菌数。如果是25×16规格的计数板，除取四个角上四中格外，还取正中的一个中格（即80小格），对位于大格线上的酵母菌只计大格的上方及左方线上的酵母菌，或只计下方及右方线上的酵母菌。每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每毫升菌液中所含的酵母菌数。酵母菌细胞数/mL=每个小格内细胞数×400×104×稀释倍数第38页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

五、实验报告

1.将实验结果填入下列空格目镜______倍，低倍镜______倍，高倍镜__

__，油镜

倍。高倍镜下，目镜测微尺_________格：镜台测微尺_______格。目镜测微尺每格=_____µm。油镜下，目镜测微尺______格＝镜台测微尺________格。目镜测微尺每格=____µm。

2.将测得的菌体大小记录于下表3-3中

3.将计数得的菌体数量记录于下表3-4中第39页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-4微生物的大小测定与计数

菌号12345678910平均值（μm）长(格）宽(格）表3-3菌体大小测量结果表3-4菌液中所含的酵母菌数计数次数左上角方格左下角方格（中央方格）右上角方格右下角方格合计平均每个小格内细胞数123稀释倍数酵母菌细胞数／mL返回第40页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-5微生物的理化性能鉴定

一、实验目的

1.了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。

2.了解不同种类的细菌对碳水化合物及含氮化合物的分解利用情况，从而认识微生物代谢类型的多样性。

3.学习平板接种法及穿刺接种法。二、实验原理由于各种微生物的新陈代谢不同，因此对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，故可利用化学反应来测定微生物的代谢物（这种反应称为生化反应），并以此作为鉴定微生物的依据。第41页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-5微生物的理化性能鉴定

三、实验材料

1.菌种枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气杆菌，普通变形杆菌。

2.培养基淀粉培养基，葡萄糖蛋白胨培养基，蛋白胨水培养基，柠檬酸铁铵固体培养基等，见附录Ⅲ。

3.试剂卢戈氏碘液，40%NaOH溶液，5%-萘酚溶液（乙醇配制），甲基红试剂，吲哚试剂（见附录Ⅴ），乙醚等。

4.其他物品无菌培养皿，无菌试管，接种环，酒精灯，接种针等。第42页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-5微生物的理化性能鉴定

四、实验方法

(一)淀粉水解试验某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。操作步骤如下：

1.将盛有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水俗中融化，然后取出冷却至50℃左右，以无菌操作倾入培养皿中约15～20mL，待凝固后制成平板。

2.翻转平皿使皿底朝上，用记号笔在其背面做好标记，以免菌种混淆。第43页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-5微生物的理化性能鉴定

3.用接种环取少量枯草芽孢杆菌在平板的一边划“+”字作为阳性对照菌；另取少量大肠杆菌或产气杆菌在平板的另一边划“+”字（图3-7），然后将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养24h。

4.观察结果打开培养皿盖，滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板，如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。第44页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-5微生物的理化性能鉴定

12图3-7淀粉水解试验接种示意图

1.枯草芽孢杆菌；2.大肠杆菌第45页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-5微生物的理化性能鉴定

(二)乙酰甲基甲醇(V.P.)试验某些细菌在糖代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，二个分子丙酮酸经缩合和脱羧生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物。此为V.P.试验的阳性反应。在试管中加入少量的-萘酚为颜色增强剂可使反应加快。第46页，共51页，2023年，2月20日，星期四

实验3-5微生物的理化性能鉴定

操作步骤如下：

1.分别接种大肠杆菌和产气杆菌于装有葡萄糖蛋白胨培养基的试管中，置于37℃恒温箱内培养24～48h，有时需延长培养到10天。

2.在已培养两天的试管内，先加入40%KOH溶液1